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VIM-2型金属β内酰胺酶的序列分析、原核表达及纯化
被引量：
1
1
作者
林孟娴
王佩芬
+1 位作者
蔡应木
钱元恕
《中国感染与化疗杂志》
CAS
2006年第3期168-171,共4页
目的对铜绿假单胞菌所产blaVIM-2进行基因重组表达及纯化。方法以产blaVIM-2铜绿假单胞菌总基因组DNA为模板,PCR扩增blaVIM-2,将其克隆入pUCm-T载体后测定该核苷酸序列,再将blaVIM-2克隆入表达载体pET-41b(+),然后在大肠埃希菌BL21(DE3...
目的对铜绿假单胞菌所产blaVIM-2进行基因重组表达及纯化。方法以产blaVIM-2铜绿假单胞菌总基因组DNA为模板,PCR扩增blaVIM-2,将其克隆入pUCm-T载体后测定该核苷酸序列,再将blaVIM-2克隆入表达载体pET-41b(+),然后在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,表达产物再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为801bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,蛋白分子质量大约为56000u。结论对VIM-2金属酶的成功表达及纯化为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定了基础。
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关键词
VIM-2型金属β内酰胺酶
克隆
原核表达及纯化
铜绿假单胞菌
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职称材料
镁螯合酶CHLI和CHLD亚基的表达纯化及其稳定复合体的鉴定
2
作者
张星亮
彭熹
+2 位作者
邓翔
刘扬
崔香淑
《沈阳农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期283-290,共8页
为明确植物光合作用中镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基形成复合物CHLI-CHLD这一重要过程的机制,首先需要获得可溶性CHLI和CHLD蛋白并确定其复合体装配。通过分子克隆技术构建截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒。将其分别转化至大肠杆菌BL21(D...
为明确植物光合作用中镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基形成复合物CHLI-CHLD这一重要过程的机制,首先需要获得可溶性CHLI和CHLD蛋白并确定其复合体装配。通过分子克隆技术构建截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒。将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。通过Ni琼脂糖树脂(Ni sepharose 6 Fast Flow)和谷胱甘肽琼脂糖树脂(Glutathionsepharose 4 Fast Flow)亲和层析纯化可溶性重组蛋白。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和TEV酶切试验验证目标蛋白。采用GST-Pulldown试验鉴定CHLI与CHLD的相互作用。通过凝胶过滤层析和SDSPAGE测定复合体中CHLI与CHLD蛋白的比例。结果表明:成功构建了截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒p ET-28a-CHLI(13-357),p ET-28a-CHLD(20-676)及p GEX-4T-2-CHLD(20-767);在18℃,0.2mmol·L-1 IPTG条件下诱导16h后,成功获得了可溶性的CHLI(13-357),CHLD(20-676)和GST-CHLD(20-676)重组表达蛋白;CHLI与CHLD存在直接相互作用且需要Mg2+和ATP;稳定复合体CHLI-CHLD的亚基比例为1∶1。综上表明原核表达及纯化镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基蛋白,在Mg2+和ATP存在的条件下通过凝胶过滤层析可获得1∶1的稳定复合体CHLI-CHLD。
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关键词
CHLI
CHLD
原核表达及纯化
蛋白复合物
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职称材料
题名
VIM-2型金属β内酰胺酶的序列分析、原核表达及纯化
被引量：
1
1
作者
林孟娴
王佩芬
蔡应木
钱元恕
机构
汕头大学医学院药理教研室
汕头大学医学院第一附属医院检验科
出处
《中国感染与化疗杂志》
CAS
2006年第3期168-171,共4页
基金
国家自然科学基金(编号:30472109)
广东省自然科学基金(编号:34616)
汕头大学研究与发展基金(编号:L00010)
文摘
目的对铜绿假单胞菌所产blaVIM-2进行基因重组表达及纯化。方法以产blaVIM-2铜绿假单胞菌总基因组DNA为模板,PCR扩增blaVIM-2,将其克隆入pUCm-T载体后测定该核苷酸序列,再将blaVIM-2克隆入表达载体pET-41b(+),然后在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,表达产物再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为801bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,蛋白分子质量大约为56000u。结论对VIM-2金属酶的成功表达及纯化为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定了基础。
关键词
VIM-2型金属β内酰胺酶
克隆
原核表达及纯化
铜绿假单胞菌
Keywords
VIM-2 metallo-β-lactamase
Clone, Prokaryotic expression and purification
Pseudomonas aeruginosa
分类号
R346 [医药卫生—基础医学]
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职称材料
题名
镁螯合酶CHLI和CHLD亚基的表达纯化及其稳定复合体的鉴定
2
作者
张星亮
彭熹
邓翔
刘扬
崔香淑
机构
广东医学院附属医院儿科
中国农业大学农业生物技术国家重点实验室
延边大学医学部护理学院
出处
《沈阳农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第3期283-290,共8页
基金
国家自然科学青年基金项目(31300602)
广东省自然科学基金项目(S2013040012902)
吉林省卫生厅基金项目(2013082)
文摘
为明确植物光合作用中镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基形成复合物CHLI-CHLD这一重要过程的机制,首先需要获得可溶性CHLI和CHLD蛋白并确定其复合体装配。通过分子克隆技术构建截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒。将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。通过Ni琼脂糖树脂(Ni sepharose 6 Fast Flow)和谷胱甘肽琼脂糖树脂(Glutathionsepharose 4 Fast Flow)亲和层析纯化可溶性重组蛋白。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和TEV酶切试验验证目标蛋白。采用GST-Pulldown试验鉴定CHLI与CHLD的相互作用。通过凝胶过滤层析和SDSPAGE测定复合体中CHLI与CHLD蛋白的比例。结果表明:成功构建了截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒p ET-28a-CHLI(13-357),p ET-28a-CHLD(20-676)及p GEX-4T-2-CHLD(20-767);在18℃,0.2mmol·L-1 IPTG条件下诱导16h后,成功获得了可溶性的CHLI(13-357),CHLD(20-676)和GST-CHLD(20-676)重组表达蛋白;CHLI与CHLD存在直接相互作用且需要Mg2+和ATP;稳定复合体CHLI-CHLD的亚基比例为1∶1。综上表明原核表达及纯化镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基蛋白,在Mg2+和ATP存在的条件下通过凝胶过滤层析可获得1∶1的稳定复合体CHLI-CHLD。
关键词
CHLI
CHLD
原核表达及纯化
蛋白复合物
Keywords
CHLI
CHLD
prokaryotic expression and purification
protein complex
分类号
S511 [农业科学—作物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
VIM-2型金属β内酰胺酶的序列分析、原核表达及纯化
林孟娴
王佩芬
蔡应木
钱元恕
《中国感染与化疗杂志》
CAS
2006
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
镁螯合酶CHLI和CHLD亚基的表达纯化及其稳定复合体的鉴定
张星亮
彭熹
邓翔
刘扬
崔香淑
《沈阳农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016
0
在线阅读
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