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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
1
作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接ELISA
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沙糖橘几丁质酶基因orange1.1t05124的克隆及原核表达
2
作者 胡亚平 陈聪 +4 位作者 吉前华 郭雁君 郭丽英 蒋惠 杨凤梅 《中国南方果树》 北大核心 2025年第1期9-15,共7页
柑橘几丁质酶作为一种重要的抗真菌蛋白,可以降解真菌细胞壁中的几丁质。利用沙糖橘的cDNA文库克隆了沙糖橘几丁质酶基因orange1.1t05124。该基因位于第8染色体末端,包含3个外显子。将该基因克隆到pEASY-Blunt E1载体中,测序验证序列无... 柑橘几丁质酶作为一种重要的抗真菌蛋白,可以降解真菌细胞壁中的几丁质。利用沙糖橘的cDNA文库克隆了沙糖橘几丁质酶基因orange1.1t05124。该基因位于第8染色体末端,包含3个外显子。将该基因克隆到pEASY-Blunt E1载体中,测序验证序列无误,随后转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导生成了目的蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)验证成功表达,在产物的包涵体中纯化到了目标蛋白。通过生物信息学分析发现,该蛋白具有信号肽,定位在细胞外,是单体的球状蛋白质。通过进化树分析发现,该几丁质酶在植物中广泛存在同源蛋白质,且都含有GH19几丁质酶催化结构域。对柑橘几丁质酶基因进行克隆和表达,可为了解该基因家族的抗病机理和开发基于几丁质酶的新型生物农药、生物肥料提供基因资源。 展开更多
关键词 沙糖橘 几丁质酶基因 原核表达 抗真菌蛋白质
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木碱蓬磷酸乙醇胺甲基转移酶基因SdNMT的原核表达及分离纯化
3
作者 马盼盼 祝建波 孙国清 《西北农业学报》 北大核心 2025年第8期1476-1483,共8页
磷酸乙醇胺甲基转移酶是一种S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶,是催化磷酸乙醇胺三步甲基化合成磷酸胆碱的关键酶,而磷酸胆碱是植物中磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱生物合成的重要前体。木碱蓬转录组测序分析结果显示,磷酸乙醇胺甲基转移酶... 磷酸乙醇胺甲基转移酶是一种S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶,是催化磷酸乙醇胺三步甲基化合成磷酸胆碱的关键酶,而磷酸胆碱是植物中磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱生物合成的重要前体。木碱蓬转录组测序分析结果显示,磷酸乙醇胺甲基转移酶基因在盐胁迫下显著上调表达。本研究以800 mmol/L NaCl处理1 d的cDNA为模板扩增获得木碱蓬磷酸乙醇胺甲基转移酶基因SdNMT的编码区序列,构建原核表达载体pET28a-SdNMT并导入大肠杆菌菌株BL21。对重组蛋白进行IPTG诱导表达、表达条件筛选优化及可溶性分析,采用镍亲和层析柱纯化目标蛋白。结果显示,成功克隆的SdNMT基因编码区序列长1 485 bp,编码494个氨基酸,预测蛋白分子质量为56.56 ku,理论等电点为5.52。重组蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达。1.0 mmol/L IPTG,15℃培养振荡16 h是目的蛋白诱导表达的最佳条件。通过Ni NTA beads 6FF纯化获得在毫克级范围内获得纯度达85%的SdNMT蛋白。研究结果为蛋白酶活性检测提供足够的材料,为深入分析SdNMT在植物生长、发育及环境胁迫响应中的功能奠定基础。 展开更多
关键词 木碱蓬 SdNMT 原核表达 蛋白纯化
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施马伦贝格病毒N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
4
作者 李阳 孙睿雪 +3 位作者 陈天杰 刘思彤 曹家慧 赵建军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3877-3887,共11页
[目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌... [目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的SBV N蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种iELISA方法,并对其包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育时间等反应条件进行优化,检测其阴阳性临界值、特异性、灵敏性和重复性。[结果]SDS-PAGE结果显示,SBV N蛋白分子质量为30 ku;Western blotting结果显示,纯化后SBV N蛋白与SBV阳性血清能产生特异性反应。本研究建立的SBV iELISA检测方法最佳条件为:SBV N抗原包被浓度4μg/mL、4℃包被12 h、1%明胶37℃封闭1 h、血清稀释度为1:200、37℃孵育1 h、1:6 000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h,其阴阳性临界值为0.371。该iELISA检测方法仅与SBV阳性血清产生特异性反应,与牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和阿卡斑病毒(AKAV)阳性血清均无明显交叉反应,灵敏性较高,SBV阳性血清稀释度为1:1280时仍有明显反应。批间重复试验和批内重复试验变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其总符合率为94.57%。[结论]本研究建立了一种以SBV N蛋白为检测抗原的SBV iELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于SBV血清学检测,试验结果为SBV的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒(SBV) N蛋白 间接ELISA(iELISA) 原核表达
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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立 被引量：1
5
作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页
绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接ELISA
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星康吉鳗LH基因的克隆、序列特征分析及原核表达 被引量：1
6
作者 陈彦 史宝 +5 位作者 王成刚 薄万军 晏科文 陶美君 赵新宇 马晓东 《渔业科学进展》 北大核心 2025年第3期40-52,共13页
促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)在鱼类配子成熟、排卵和类固醇激素合成方面发挥重要作用。通过同源克隆获得星康吉鳗(Conger myriaster)LH基因CDS区序列,利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的结构与特征,并成功构建原核表达... 促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)在鱼类配子成熟、排卵和类固醇激素合成方面发挥重要作用。通过同源克隆获得星康吉鳗(Conger myriaster)LH基因CDS区序列,利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的结构与特征,并成功构建原核表达重组质粒对LH蛋白进行表达。克隆获得LH基因CDS区为423 bp,编码140个氨基酸。分析LH蛋白理化性质可知,其相对分子质量为15.56 kDa,理论等电点为5.85;经亲疏水性分析发现,LH蛋白为亲水性蛋白;对信号肽和跨膜区分析结果显示,其前1~22个氨基酸为信号肽,无跨膜区;经结构域分析,其存在保守性较强的GHB结构域(由27~132位的105个氨基酸组成);亚细胞定位分析表明,LH蛋白主要定位于细胞核;对糖基化位点及磷酸化位点分析发现,其存在1个N-糖基化位点和3个O-糖基化位点,共含有17个潜在的磷酸化位点;LH蛋白二级结构主要含有α-螺旋(13.6%)、β-折叠(25%)和无规则卷曲(61.4%);通过三级结构分析发现,其与日本鳗鲡(Anguilla japonica)LH蛋白三级结构较为相似,与人(Homo sapiens)LH蛋白的三级结构存在一定差异。多序列比对及系统发育树分析结果显示,LH与欧洲鳗鲡(A.anguilla)、花鳗鲡(A.marmorata)和日本鳗鲡进化关系较近,同源性分别为92.14%、91.43%和90.71%。构建的重组质粒pET-28a-LH在Rosetta(DE3)感受态细胞中成功表达,其表达的可溶性LH重组融合蛋白条带在SDS-PAGE电泳检测及Western Blot结果中约为26.5 kDa,与预期表达的分子量相符。该研究为揭示星康吉鳗LH基因的分子特征及蛋白功能奠定了基础,为后续星康吉鳗人工繁育技术的优化提供了理论参考。 展开更多
关键词 星康吉鳗 促黄体生成素基因 基因克隆 序列特征分析 原核表达
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猪德尔塔冠状病毒截短S1蛋白原核表达与多克隆抗体制备
7
作者 叶曼青 叶晨倩 +10 位作者 秦文珍 杨心雨 翟雪滢 郑浩 童武 李国新 于海 童光志 孔宁 李智丽 单同领 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期132-138,共7页
自2014年猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)在美国暴发以来,严重危害生猪健康,给各国的经济带来重大压力。本试验拟将PDCoV S1蛋白截短,通过原核表达获得重组蛋白,并且制备对应的多克隆抗体。利用生物信息学软件对PDCoV S1蛋白的亲疏水性进行分析... 自2014年猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)在美国暴发以来,严重危害生猪健康,给各国的经济带来重大压力。本试验拟将PDCoV S1蛋白截短,通过原核表达获得重组蛋白,并且制备对应的多克隆抗体。利用生物信息学软件对PDCoV S1蛋白的亲疏水性进行分析,将其截短为3个相互重叠的基因片段,并通过原核表达获得重组蛋白。以重组蛋白为抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示:截短获得的3个重组蛋白均在包涵体中稳定表达,通过间接ELISA、Western blot和IFA检测方法,表明制备的多克隆抗体具有良好的抗体效价和特异性识别能力。本研究制备出特异性识别PDCoV S蛋白的多克隆抗体,为后续研究PDCoV S蛋白的结构和功能提供了工具,为建立PDCoV诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 PDCoV S蛋白 截短蛋白 原核表达 多克隆抗体
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牛冠状病毒N基因的原核表达和多克隆抗体的制备
8
作者 刘文锴 曹兴旺 +9 位作者 汪萍 金映红 薛晶 李月 梁纤纤 李晓卓 韩翔舒 郑启铭 蒋松 夏俊 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期23-27,共5页
为制备牛冠状病毒N蛋白多克隆抗体,建立简单快捷的牛冠状病毒检测方法。根据牛冠状病毒N基因序列设计引物,将N基因重组至PET-30a载体上,经PCR及测序鉴定重组载体构建成功;将构建的PET-30a-N重组质粒转入大肠埃希氏菌DH5-α和Rosetta(DE3... 为制备牛冠状病毒N蛋白多克隆抗体,建立简单快捷的牛冠状病毒检测方法。根据牛冠状病毒N基因序列设计引物,将N基因重组至PET-30a载体上,经PCR及测序鉴定重组载体构建成功;将构建的PET-30a-N重组质粒转入大肠埃希氏菌DH5-α和Rosetta(DE3)感受态细胞,进行扩增和诱导表达,后经超声破碎后获取N蛋白并进行蛋白纯化;最后将纯化后的N蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫新西兰白兔,共制得35 mL抗N蛋白多克隆抗体血清,经Western blot和IFA鉴定,抗N蛋白多克隆抗体有良好的特异性,试验制备的抗N蛋白牛冠状病毒多克隆抗体可用于牛冠状病毒的检测。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 N蛋白 多克隆抗体 原核表达
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犬副流感病毒F基因原核表达及多克隆抗体的制备
9
作者 刘禹含 叶雨濛 +7 位作者 麦嘉迅 程松 孟春春 朱杰 刘光清 王勇 巴音查汗·盖力克 李传峰 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期139-145,共7页
本研究利用原核表达系统表达犬副流感病毒(CPIV)F蛋白,并制备CPIV-F蛋白多克隆抗体。依据CPIV SH2021株F基因设计引物,扩增获得去除信号肽的F基因片段,并构建了重组表达质粒pET-42a-CPIV-F,经测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21中,经IPT... 本研究利用原核表达系统表达犬副流感病毒(CPIV)F蛋白,并制备CPIV-F蛋白多克隆抗体。依据CPIV SH2021株F基因设计引物,扩增获得去除信号肽的F基因片段,并构建了重组表达质粒pET-42a-CPIV-F,经测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达重组蛋白,并优化了诱导剂浓度及诱导时间。采用包涵体粗提纯化法对重组CPIV-F蛋白进行纯化,并测定了重组蛋白浓度。用纯化的重组CPIV-F蛋白制备其兔源多克隆抗体,通过Western blot和ELISA鉴定了多克隆抗体特异性和效价。结果显示:试验成功构建pET-42a-CPIV-F原核表达质粒并表达出重组CPIV-F蛋白;SDS-PAGE法和Western blot结果表明,重组CPIV-F蛋白可在大肠杆菌中的表达,大小为89 kDa,优化后的IPTG终浓度为1 mmol/L,诱导4 h表达量最大,重组蛋白浓度为2.3 mg/mL,兔抗CPIV-F抗体可以与重组蛋白发生特异性反应;间接ELISA测得兔抗CPIV-F蛋白多克隆抗体效价为1∶102400。本研究制备的兔源多克隆抗体特异和高效,表明F蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究CPIV F蛋白的生物学功能及建立相关的免疫学检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 犬副流感病毒 F基因 原核表达 多克隆抗体
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细粒棘球绦虫EgBAL蛋白的生物信息学分析及原核表达
10
作者 赵文卿 薄新文 +6 位作者 普娜 张玉霞 陈旭珂 张艳艳 孙艳 齐萌 王正荣 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期801-810,共10页
[目的]探究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)胆盐活化脂肪酶(EgBAL)的生物信息学特征并进行原核表达,检测EgBAL重组蛋白的免疫原性,为囊性棘球蚴病疫苗抗原筛选提供理论依据。[方法]从NCBI数据库获取细粒棘球绦虫EgBAL基因序列(Ge... [目的]探究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)胆盐活化脂肪酶(EgBAL)的生物信息学特征并进行原核表达,检测EgBAL重组蛋白的免疫原性,为囊性棘球蚴病疫苗抗原筛选提供理论依据。[方法]从NCBI数据库获取细粒棘球绦虫EgBAL基因序列(GenBank登录号:HM748917),设计特异性引物,以细粒棘球绦虫原头蚴cDNA为模板,通过PCR扩增并克隆EgBAL基因。使用Mega 7.0软件,通过邻接法(NJ)构建系统进化树,运用生物信息学软件对EgBAL蛋白理化性质和结构特征进行预测分析。构建含EgBAL基因重组pET-22b质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞诱导表达EgBAL重组蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,并进行纯化。利用Western blotting分析重组蛋白的免疫原性。[结果]细粒棘球绦虫EgBAL基因片段大小为1 020 bp。系统进化树显示,EgBAL蛋白与中华树鼩EgBAL蛋白处于同一分支,进化距离较近,相似性高达99.60%。生物信息学分析显示,EgBAL基因全长1 014 bp,编码337个氨基酸,EgBAL蛋白分子质量为37 089.59 u,理论等电点为4.77,不稳定指数为44.72,为不稳定蛋白,脂肪系数为66.11,亲水性为-0.429,为亲水性蛋白,无跨膜区域及信号肽。EgBAL蛋白具有14个潜在B细胞抗原表位,二级结构包括α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲,分别占27.90%、12.76%、12.76%和56.08%。此外,EgBAL蛋白含有35个磷酸化位点,其中包括12个丝氨酸磷酸化位点、16个苏氨酸磷酸化位点和7个酪氨酸磷酸化位点。本研究成功构建重组pET-22b-EgBAL质粒,诱导表达得到EgBAL重组蛋白大小约38 ku。Western blotting结果显示,该重组蛋白可被细粒棘球绦虫感染的昆明小鼠和犬的阳性血清识别,具有良好的免疫原性。[结论]本研究成功克隆了细粒棘球绦虫EgBAL基因、表达了EgBAL重组蛋白,并初步证实重组EgBAL蛋白具有较好的免疫原性,提示其有作为囊型棘球蚴病疫苗或诊断候选抗原的潜力,为进一步研究EgBAL蛋白的功能提供了科学依据。 展开更多
关键词 细粒棘球绦虫 EgBAL基因 生物信息学分析 原核表达
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猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及多克隆抗体制备
11
作者 叶晨倩 李智丽 +11 位作者 叶曼青 秦文珍 杨心雨 翟雪滢 郑浩 童武 李国新 于海 童光志 单同领 娄华 孔宁 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期164-170,共7页
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新发的病原体,引起仔猪腹泻、脱水和呕吐等症状。本研究以PDCoV的RNA为模板,扩增PDCoV N基因,将其插入原核表达载体pColdⅠ中,构建PDCoV N-pColdⅠ质粒;通过BL21(DE3)原核表达和纯化获得高纯度的PDCoV N蛋... 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新发的病原体,引起仔猪腹泻、脱水和呕吐等症状。本研究以PDCoV的RNA为模板,扩增PDCoV N基因,将其插入原核表达载体pColdⅠ中,构建PDCoV N-pColdⅠ质粒;通过BL21(DE3)原核表达和纯化获得高纯度的PDCoV N蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备PDCoV N蛋白多克隆抗体。结果显示:原核表达的PDCoV N蛋白为可溶性蛋白,分子量约为40 kDa;通过ELISA、Western blot和IFA鉴定可知,本研究制备的PDCoV N多克隆抗体均具有良好的效价,可为深入开展PDCoV相关的基础和应用研究提供工具。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体
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小菜蛾PxylPBAN的克隆、原核表达及其RNAi对保幼激素和性信息素通路基因表达的影响
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作者 郑月琴 祝潇雯 +3 位作者 田厚军 林硕 刘倩霞 魏辉 《昆虫学报》 北大核心 2025年第5期576-584,共9页
【目的】通过对小菜蛾Plutella xylostella性信息素生物合成激活神经肽基因PxylPBAN进行克隆、原核表达,并检测RNAi沉默PxylPBAN对小菜蛾保幼激素通路和性信息素合成通路基因表达的影响,探讨PxylPBAN在性信息素合成中的作用。【方法】利... 【目的】通过对小菜蛾Plutella xylostella性信息素生物合成激活神经肽基因PxylPBAN进行克隆、原核表达,并检测RNAi沉默PxylPBAN对小菜蛾保幼激素通路和性信息素合成通路基因表达的影响,探讨PxylPBAN在性信息素合成中的作用。【方法】利用RT-PCR克隆小菜蛾PxylPBAN的CDS全长序列;原核表达PxylPBAN并纯化;通过将dsPxylPBAN注射进小菜蛾雌蛹,利用RNAi沉默PxylPBAN,并利用RT-qPCR验证RNAi后24, 48和72 h时PxylPBAN以及保幼激素通路基因(PxylJHAMT,PxylnJHBP,PxylhJHBP和PxylMet)和性信息素合成通路基因(PxylACC和PxylFAR6)的表达量。【结果】克隆得到小菜蛾PxylPBAN(GenBank登录号:LOC105391112),全长CDS 582 bp,编码193个氨基酸,蛋白预测分子量约为21.85 kD;原核表达获得PxylPBAN重组蛋白。RNAi结果表明与注射dsEGFP的对照比较,注射dsPxylPBAN后小菜蛾PxylPBAN的表达量显著下调,且注射后24 h时下调最显著;此外,PxylJHAMT,PxylnJHBP,PxylhJHBP,PxylMet,PxylACC和PxylFAR6的表达量也显著下调。【结论】本研究成功获得PxylPBAN重组蛋白,发现PxylPBAN是小菜蛾保幼激素通路和性信息素合成通路的重要枢纽基因,为揭示小菜蛾PxylPBAN与保幼激素对性信息素生物合成的联动调控模式奠定理论基础。 展开更多
关键词 小菜蛾 性信息素生物合成激活神经肽 保幼激素 基因克隆 原核表达 RNA干扰
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猪α干扰素8s突变体原核表达及其体内外活性鉴定
13
作者 吴琼 李凌丹 +7 位作者 袁辉 宾晨 邓可 李伟 叶十一 李国攀 沈青春 熊涛 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第5期2413-2423,共11页
猪α干扰素(PoIFN-α)可用于治疗和预防病毒感染,但天然猪α干扰素抗病毒活性低,寻找高生物活性的突变体序列对猪传染性疾病的防治措施研究具有重要意义。运用生物信息学方法分析和比对PoIFN-α的各亚型氨基酸序列,对天然PoIFN-α序列... 猪α干扰素(PoIFN-α)可用于治疗和预防病毒感染,但天然猪α干扰素抗病毒活性低,寻找高生物活性的突变体序列对猪传染性疾病的防治措施研究具有重要意义。运用生物信息学方法分析和比对PoIFN-α的各亚型氨基酸序列,对天然PoIFN-α序列的八个位点进行定点突变构建PoIFN-α8s突变体并进行原核表达纯化;获得重组蛋白后在PK-15细胞上针对水疱性口炎病毒(VSV)进行活性测定,同时在小鼠体内验证PoIFN-α8s突变体对猪伪狂犬病病毒(PRV)的抑制能力。结果发现,重组PoIFN-α8s测得抗病毒活性为1.13×10^(7)IU·mg^(-1),对比PoIFN-α产品,PoIFN-α8s可降低PK-15细胞上VSV的病毒滴度和基因拷贝数达10倍以上,具有更高的体外抑制VSV增殖能力;动物试验表明,PoIFN-α8s可降低感染PRV小鼠体内各器官的病毒载量。综上,本研究成功构建高效的PoIFN-α8s突变体,并验证了其良好的体内外抗病毒活性。 展开更多
关键词 猪Α干扰素 原核表达 突变 生物信息学分析 抗病毒活性
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葡聚糖和壳聚糖双功能酶的原核表达及酶学性质研究
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作者 张婉莹 孙君珂 +4 位作者 李雪晖 邓若竹 王娟 胡凡 柯涛 《饲料工业》 北大核心 2025年第10期132-140,共9页
β-葡聚糖酶能水解谷物中的β-葡聚糖,在食品及饲料工业中被广泛应用。文章通过对前期筛选的可降解天然纤维素的复合菌系CM3宏基因组测序数据筛选获得的一个新型糖苷水解酶GH8家族的β-葡聚糖和壳聚糖双功能酶基因Glu7进行原核表达和酶... β-葡聚糖酶能水解谷物中的β-葡聚糖,在食品及饲料工业中被广泛应用。文章通过对前期筛选的可降解天然纤维素的复合菌系CM3宏基因组测序数据筛选获得的一个新型糖苷水解酶GH8家族的β-葡聚糖和壳聚糖双功能酶基因Glu7进行原核表达和酶学性质研究。通过密码子优化合成基因全长序列,并构建重组表达载体pET-30a(+)-Glu7,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。重组酶Glu7分子量约为42.60 kDa,IPTG终浓度0.25 mmol/L,37℃诱导6 h表达量最高,其β-葡聚糖酶和壳聚糖酶的酶活力分别达到112.76 U/mL和63.32 U/mL。β-葡聚糖酶和壳聚糖酶最适温度均为50℃,最适pH分别为6.0和7.0,且β-葡聚糖酶在50℃下处理60 min仍保持80%以上酶活;经Ni-NTA柱纯化后Glu7的β-葡聚糖酶和壳聚糖酶比活力分别为153.89 U/mg和79.05 U/mg。此外,5 mmol/L的Cu^(2+)和Co^(2+)对双酶同时具有最高激活作用,分别提高了壳聚糖酶活力的80.73%和4.38%,β-葡聚糖酶活力的18.18%和134.03%。水解大麦葡聚糖和壳聚糖的最终主要产物分别是纤维二糖、葡萄糖和壳三糖,水解香菇多糖和牛肝菌多糖的主要产物分别是葡糖胺和纤维二糖。通过生物信息学分析及水解产物表明该酶属于1,3-1,4-β-葡聚糖酶。 展开更多
关键词 宏基因组学 β-葡聚糖和壳聚糖双功能酶 原核表达 酶学性质 水解特性
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羚牛IFN-γ基因克隆、生物信息学分析与原核表达
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作者 柳丽 姚宇航 +4 位作者 刘晨阳 张文涛 马俊杰 昝林森 成功 《西北农业学报》 北大核心 2025年第2期319-328,共10页
旨在研究羚牛γ干扰素(IFN-γ)基因结构与功能,为进一步增强羚牛的免疫调节能力提供理论依据。通过RT-PCR方法克隆羚牛IFN-γ基因,并运用多种生物信息学分析工具对其结构与功能进行深入研究。将IFN-γ基因序列连入原核表达载体,并转化... 旨在研究羚牛γ干扰素(IFN-γ)基因结构与功能,为进一步增强羚牛的免疫调节能力提供理论依据。通过RT-PCR方法克隆羚牛IFN-γ基因,并运用多种生物信息学分析工具对其结构与功能进行深入研究。将IFN-γ基因序列连入原核表达载体,并转化大肠杆菌诱导表达。结果显示,羚牛IFN-γcDNA序列全长501 bp,编码166个氨基酸。蛋白高级结构预测结果显示,二级结构以α螺旋为主,存在13个磷酸化修饰位点,并含有1个信号肽、1个低度复杂区、1个跨膜结构域及1个IFN-γ结构域,其中IFN-γ结构域位于胞外区。序列比对分析发现其与绵羊、山羊、家牛、水牛、人、黑猩猩、小鼠、鸡的核苷酸序列同源性分别为99.0%、98.8%、97.2%、96.2%、75.8%、75.4%、64.1%、54.1%,氨基酸序列同源性分别为99.4%、99.4%、95.8%、95.8%、62.7%、62.7%、43.9%、33.5%。系统进化树分析结果显示,羚牛与山羊、绵羊的亲缘关系最近。经SDS-PAGE和Western-blot检测发现,重组IFN-γ蛋白以可溶性形式大量表达,分子质量约为34 ku。通过密码子优化及不同浓度IPTG诱导表达等原核表达优化策略发现,密码子优化能促进重组蛋白的高效表达,且最佳诱导浓度为0.9 mmol·L^(-1)。 展开更多
关键词 羚牛 IFN-Γ 基因克隆 生物信息学分析 原核表达 IPTG诱导
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柔嫩艾美耳球虫AMA1的原核表达及其免疫保护效果评价
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作者 刘永宁 单乙戈 +5 位作者 潘晨帆 刘倩琳 李翌琳 段思彰 安健 张建军 《华北农学报》 北大核心 2025年第1期232-238,共7页
为探究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(AMA1)对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡的免疫保护效果,将AMA1基因扩增产物连接到表达载体pET-32a(+)上构建重组质粒pET-32a(+)-AMA1,并转入大肠杆菌BL21(DE3)来表达重组蛋白。将108只雏鸡随机分为6组,每组3个... 为探究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(AMA1)对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡的免疫保护效果,将AMA1基因扩增产物连接到表达载体pET-32a(+)上构建重组质粒pET-32a(+)-AMA1,并转入大肠杆菌BL21(DE3)来表达重组蛋白。将108只雏鸡随机分为6组,每组3个重复,每个重复6羽,包括不免疫不攻虫组(阴性组)、不免疫攻虫组(阳性组)、弗氏佐剂对照组及12.5,25.0,50.0μg rEtAMA1免疫组,分别于14,21日龄肌肉注射不同浓度的重组蛋白,28日龄口服感染5×10^(4)个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,35日龄处死试验鸡,以体增质量、盲肠病变评分、卵囊产量、免疫器官指数、细胞因子及抗体水平来评价重组AMA1蛋白的免疫保护效果。结果显示,各组间的平均增质量差异不显著;25.0μg及50.0μg rEtAMA1组的盲肠病变计分较阳性组分别显著降低了53%和41%;12.5,25.0,50.0μg rEtAMA1组的克粪便卵囊数量(OPG)分别较阳性组显著减少16%,27%,54%;50.0μg rEtAMA1组的法氏囊指数较阳性组显著提高27%;25.0,50.0μg rEtAMA1组的胸腺指数均显著高于阳性组,分别增加了25%,22%;各组的脾脏指数无显著差异;在二免后7 d, 12.5μg和25.0μg rEtAMA1组的细胞因子IL-2和IFN-γ含量均显著高于阴性组,50.0μg rEtAMA1组血清总IgG含量较阴性组显著增加47%,且二免后含量明显高于首免后。综上,重组AMA1蛋白能够减轻盲肠病变,减少球虫卵囊产量和促进免疫器官发育,提高血清细胞因子和抗体水平,对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡具有一定的免疫保护效果。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 AMA1 原核表达 免疫效果
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坦布苏病毒NS1蛋白的原核表达、生物信息学分析及鼠源多克隆抗体制备
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作者 李娜 林翠 +4 位作者 吴诚诚 张帆帆 谭佳 黄江南 李海琴 《南方农业学报》 北大核心 2025年第3期962-972,共11页
[目的]对坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)NS1蛋白进行生物信息学分析,原核表达NS1蛋白并制备鼠源NS1多克隆抗体,为TMUV检测及NS1蛋白功能研究提供理论基础。[方法]使用ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、NetPhos 3.1、NetN... [目的]对坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)NS1蛋白进行生物信息学分析,原核表达NS1蛋白并制备鼠源NS1多克隆抗体,为TMUV检测及NS1蛋白功能研究提供理论基础。[方法]使用ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、NetPhos 3.1、NetNGlyc-1.0、YinOYang-1.2、SOPMA、AlphaFold2等生物信息学软件分析NS1蛋白氨基酸组成、理论等电点、亲/疏水性、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构。扩增NS1基因,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达NS1蛋白。NS1蛋白经尿素处理后使用Ni^(2+)-NTA亲和层析纯化并浓缩,随后使用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。制备鼠源NS1多克隆抗体,建立间接ELISA检测方法,检测鼠源NS1多克隆抗体效价和特异性。[结果]生物信息学分析结果显示,NS1蛋白编码320个氨基酸残基,分子质量约36.1 kD,理论等电点8.24,为稳定的亲水性蛋白。NS1蛋白不存在跨膜结构域和信号肽,具有42个磷酸化位点(22个丝氨酸位点、17个苏氨酸位点和3个酪氨酸位点)和13个糖基化位点(3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点)。NS1蛋白二级结构中α-螺旋占21.88%,延伸链占25.00%,β-转角占11.87%,无规则卷曲占41.25%,NS1蛋白三级结构由2个结构域组成。成功构建原核表达载体pET-28a-NS1,经纯化后成功获得NS1蛋白。制备的鼠源NS1多克隆抗体经间接ELISA检测效价达1∶3276800,可用于TMUV的特异性检测和间接免疫荧光分析。[结论]NS1蛋白不含信号肽和跨膜结构域,为亲水性蛋白,适合在原核系统内表达。利用原核表达系统成功构建pET-28a-NS1,通过尿素变性及Ni~2+-NTA亲和层析纯化后得到纯度和生物学活性较高的NS1蛋白。成功制备效价高、特异性强的鼠源NS1多克隆抗体,可用于TMUV的特异性检测。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 NS1蛋白 原核表达 多克隆抗体
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猪捷申病毒5型VP1蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立
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作者 邵永恒 倪民婷 +6 位作者 高梦玲 汤娇 张耕馨 林圣宇 刘光亮 陈佳宁 王雯慧 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期883-889,共7页
旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该... 旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该病原亚型众多,不同亚型间临床表现差异较大,且缺乏高效、特异的血清学检测方法,阻碍了对PTV-5的防治。本研究针对危害较大的PTV-5构建了pET-30a-VP1重组质粒,通过原核表达获得了VP1蛋白,以纯化的VP1为包被抗原,经条件优化成功建立了针对PTV-5的间接ELISA方法。该方法与常见猪源病毒标准阳性血清无交叉反应,最低检测稀释度为1∶3200,批内与批间变异系数均低于10%,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法对东北地区279份临床样本进行检测,其阳性率为67.74%,与报道的流行情况相符。本研究建立的间接ELISA检测方法综合评价良好,为PTV-5的临床检测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪捷申病毒 VP1蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪副流感病毒5型HN蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立
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作者 倪民婷 张耕馨 +3 位作者 孙普 刘光亮 陈佳宁 王金涛 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期52-57,共6页
为建立5型猪副流感病毒(Porcine parainfluenza virus 5,PPIV5)的血清学检测方法,用原核表达系统对PPIV5 HN蛋白进行重组表达,并用该重组蛋白进行PPIV5 ELISA检测方法的建立。结果显示,重组HN蛋白大小约为60 ku,反应性良好,以200 ng/孔... 为建立5型猪副流感病毒(Porcine parainfluenza virus 5,PPIV5)的血清学检测方法,用原核表达系统对PPIV5 HN蛋白进行重组表达,并用该重组蛋白进行PPIV5 ELISA检测方法的建立。结果显示,重组HN蛋白大小约为60 ku,反应性良好,以200 ng/孔包被抗原,10%BSA封闭30 min,1∶400稀释待检血清,1∶10000稀释二抗孵育30 min,显色5 min为最佳反应条件,该方法与猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒等阳性血清均无交叉反应,特异性好,PPIV5阳性血清最低检测稀释度为1∶800,敏感性高,批内和批间的变异系数均小于5%,重复性好。表明建立的ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为PPIV5的血清学诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 猪副流感病毒5型 HN蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪防御素-1的原核表达及抑菌效应分析
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作者 国德洋 胡慧 +1 位作者 郑雪莉 姜艳芬 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2836-2846,共11页
旨在探究原核表达的猪防御素-1(porcineβ-defensin-1)的体内外抑菌作用,为临床乳房炎的治疗提供材料和理论依据。本试验通过构建PBD-1的原核表达载体,优化诱导表达条件,过量表达纯化后测定最小抑菌浓度并绘制杀菌动力曲线。分别用E.col... 旨在探究原核表达的猪防御素-1(porcineβ-defensin-1)的体内外抑菌作用,为临床乳房炎的治疗提供材料和理论依据。本试验通过构建PBD-1的原核表达载体,优化诱导表达条件,过量表达纯化后测定最小抑菌浓度并绘制杀菌动力曲线。分别用E.coli 13-1和S.aureus 4-1构建小鼠乳房炎模型,并用不同浓度的PBD-1进行乳房内灌注治疗试验,通过乳腺组织病理变化及其载菌量观察治疗效果。结果显示,成功构建PBD-1的原核表达载体,重组PBD-1为可溶性表达,表达量为328.6 mg·mL^(-1)。体外抑菌试验显示,PBD-1对E.coli 13-1、S.aureus 4-1和S.epidermidis 25-1均有抑制作用,且MIC为82.15μg·mL^(-1)。乳房内灌注试验结果显示,1×MIC和2×MIC的PBD-1对S.aureus 4-1和E.coli 13-1小鼠乳房炎模型有一定的治疗作用。重组PBD-1对3种细菌均具有体外抑制作用,且对S.aureus 4-1和E.coli 13-1的乳房炎模型具有治疗作用。 展开更多
关键词 原核表达 乳房炎 猪防御素-1 体外抑菌 动物模型
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