人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选 被引量：4

1

作者 吴国球 刘乃丰 +3 位作者 赵桂琴 范小波 张臣 王明虹 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期464-468,共5页

目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲... 目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。 展开更多

关键词 结缔组织生长因子 噬菌体展示 人源单链可变区片段

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人源性抗SARS-CoV-2单链抗体文库的构建及广谱中和抗体的筛选与鉴定

2

作者 尹慧敏 吕海 +3 位作者 迟莹 刘静娴 焦永军 卫平民 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第2期154-160,共7页

目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA... 目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板构建人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库;利用噬菌体展示技术筛选对SARS-CoV-2 S蛋白具有特异性的scFv抗体。通过序列分析和人源IgG抗体表达,合成IgG全抗体,并评估其对SARS-CoV-2的结合能力及中和活性。结果成功构建了库容量为1.56×10^(7)CFU的SARS-CoV-2人源性scFv抗体文库,筛选出两种特异性scFv抗体;并将scFv抗体表达成IgG形式的全抗体(IgG-A10和IgG-G6),其中IgG-A10对SARS-CoV-2原始株(WT)和奥密克戎亚型变异毒株XBB(XBB)毒株均具有较好中和活性,对奥密克戎BA.2.86变异株的第二代亚分支JN.1(JN.1)毒株中和效果一般。结论本研究从康复者外周血中成功构建了人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库,并筛选表达出具有中和活性的抗SARS-CoV-2 IgG抗体,为SARS-CoV-2感染的预防、诊断和治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 SARS-CoV-2 单链可变片段(scfv) 噬菌体展示技术 中和抗体

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一种可溶性单抗ScFv片段的表达及鉴定 被引量：1

3

作者 钟小林 高会广 +1 位作者 吉清 黄刚 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第8期691-694,共4页

目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 ... 目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 15 1进行可溶性抗体表达 ,经点印迹和Western印迹检测可溶性单抗ScFv的表达水平 ,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。用双脱氧法对组成ScFvDNA的VH和VLDNA进行序列测定。结果　可溶性MC3ScFv获得了成功表达 ,表达产物主要位于周质腔中 ,其分子量约为 3 2× 10 3。来自所获得的 3个克隆周质提取物均能抑制单抗与高水平表达MC3结合抗原的AGS细胞结合 ,抑制率分别为 41.19%、3 6.89%、3 3 .77%。对ScFv的VH和VLDNA的测序结果表明所获抗体的可变区基因属IgG1亚族 ,κ型。结论　利用大肠杆菌HB2 15 1成功表达了具有抗原结合活性的MC3ScFv ,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。 展开更多

关键词 结肠癌 单克隆抗体 单链可变区片段 噬菌体

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融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析 被引量：3

4

作者 高国辉 王金丹 +5 位作者 黄奇迪 杨纪峰 杨水兵 包兵兵 张羽 胡孝渠 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期1034-1040,共7页

目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达... 目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。 展开更多

关键词 抗HER2单链抗体可变区片段 绿色荧光蛋白 融合基因表达

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特异性结合革兰氏阴性菌外膜蛋白C的单链抗体核糖体展示文库的构建

5

作者 王潇 王秀敏 +3 位作者 管庆丰 滕达 姚军虎 王建华 《中国饲料》 北大核心 2015年第9期19-22,29,共5页

以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白Omp C免疫BALB/c小鼠,提取骨髓浆细胞总RNA,逆转录获得c DNA,作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。由(Gly4Ser)3 linker连接两片段,获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCR添加T7启动子、核... 以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白Omp C免疫BALB/c小鼠,提取骨髓浆细胞总RNA,逆转录获得c DNA,作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。由(Gly4Ser)3 linker连接两片段,获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCR添加T7启动子、核糖体结合位点、gⅢtether和两端茎环结构等元件,成功构建对外膜蛋白C具有特异性亲和力的单链抗体可变区的核糖体展示文库,为特异性强、亲和力高的单链抗体可变区筛选提供了技术和材料基础。构建能与革兰氏阴性菌外膜蛋白C特异性结合的鼠源单链抗体核糖体展示文库,是奠定构建饲料革兰氏阴性腐败菌分子预警和靶向抗菌剂的靶向定位区的高亲和力单链抗体可变区片段的重要基础,对建立有害革兰氏阴性菌分子检测方法和靶向抗革兰氏阴性菌菌剂设计方法具有借鉴作用。 展开更多

关键词 外膜蛋白C 单链抗体可变区片段 核糖体展示 文库

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单链抗体表达研究进展 被引量：5

6

作者 邓亮 舒建昌 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2009年第2期321-322,共2页

单链抗体（single-chain antibody fragment．scFv）由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽（1inker）连接而成。在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物，将极大增强对靶细胞的杀伤能力。Kanter等研究发现... 单链抗体（single-chain antibody fragment．scFv）由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽（1inker）连接而成。在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物，将极大增强对靶细胞的杀伤能力。Kanter等研究发现将个体基因型scFv和细胞因子粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子或免疫刺激肽组成融合蛋白，是一种有效治疗淋巴瘤的疫苗。Wang等通过抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和抗单端孢霉毒素（ZEN）seFv基因融合，表达为抗DON和抗ZEN scFv，结果显示双功能抗体成功构建．并可应用于DON和ZEN检测。 展开更多

关键词 抗体表达 单链抗体 巨噬细胞集落刺激因子 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 scfv 生物毒素 轻链可变区 重链可变区

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抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因克隆及其结构分析

7

作者 马兰 刘爱平 +1 位作者 王佳 王小红 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期2064-2070,共7页

【目的】克隆构建黄曲霉毒素B1(AFB1)单链抗体(scFv)基因,并对其编码蛋白序列和结构进行分析预测,为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据。【方法】以抗AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株为原料,通过PCR扩增重链可变区(VH)和... 【目的】克隆构建黄曲霉毒素B1(AFB1)单链抗体(scFv)基因,并对其编码蛋白序列和结构进行分析预测,为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据。【方法】以抗AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株为原料,通过PCR扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),以(Gly4Ser)3为柔性接头(Linker)拼接构建抗AFB1 scFv基因,并采用在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列、理化性质及蛋白结构进行分析预测。【结果】抗AFB1 scFv基因全长744 bp,编码248个氨基酸,分子量为26312.05 Da,理论等电点(pI)5.70,其二级结构中含有35个α-螺旋(占14.11%)、28个β-折叠(占11.29%)、85个延伸链(占34.28%)和100个随机卷曲(占40.32%),在三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近,形成典型的抗体结构——沟槽结构,是scFv的抗原结合区域。【结论】构建的抗AFB1 scFv其VH含有117个氨基酸、VL含有116个氨基酸,具备典型抗体结构——沟槽结构,能与抗原特异性结合。 展开更多

关键词 黄曲霉毒素B1(AFB1) 单链抗体(scfv) 重链可变区(VH) 轻链可变区(VL) 沟槽结构

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scFv亲和力对CAR-T细胞抗肿瘤能力的影响 被引量：2

8

作者 张代群 李峰 +3 位作者 王淑敏 张凯 石晓娟 张毅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1044-1048,1057,共6页

目的:比较抗原亲和力不同的scFv片段对CAR-T细胞增殖、分化和抗肿瘤能力的影响。方法:分别构建靶向ErbB2的FRP5(K_D=30 nmol/L)和chA21(K_D=11 nmol/L)CAR慢病毒表达载体,包装病毒后制备CD8^+CAR-T细胞;在CAR-T细胞扩增过程中,通过计数... 目的:比较抗原亲和力不同的scFv片段对CAR-T细胞增殖、分化和抗肿瘤能力的影响。方法:分别构建靶向ErbB2的FRP5(K_D=30 nmol/L)和chA21(K_D=11 nmol/L)CAR慢病毒表达载体,包装病毒后制备CD8^+CAR-T细胞;在CAR-T细胞扩增过程中,通过计数细胞来检测细胞增殖;利用流式细胞术检测CAR-T细胞分化情况;利用荧光素酶活性法检测杀伤活性;用ELISA检测CAR-T细胞在肿瘤识别过程中IL-2和IFN-γ的分泌情况;利用成像流式细胞仪检测scFv亲和力对CAR-T细胞形成免疫突触能力的影响。结果:成功构建了CD8^+ CAR-T细胞,FRP5和chA21 CAR阳性率均达50%左右;CAR-T细胞的增殖和分化状态没有差异;荧光素酶活性法显示chA21-CAR-T细胞裂解肿瘤细胞的能力较强;ELISA检测结果显示chA21-CAR-T细胞分泌细胞因子能力更强;chA21-CAR-T细胞形成免疫突触的能力更强。结论:包含高亲和力scFv的chA21-CAR-T细胞具有较强的抗原依赖性杀伤活性。 展开更多

关键词 单链可变区(scfv) ERBB2 亲和力 嵌合抗原受体T细胞 细胞杀伤

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应用噬菌体展示随机12肽库筛选诺如病毒抗原模拟表位

9

作者 周飞园 王璐 +6 位作者 梁芷妍 林璧慧 李佳恒 王宇 井多娜 张绪富 戴迎春 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期383-388,共6页

目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位。方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。ELISA鉴定淘选所得噬菌体与... 目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位。方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。ELISA鉴定淘选所得噬菌体与scFv的结合活性及其与NoV P蛋白的竞争作用;阳性克隆测序后进行生物信息学分析,合成多肽鉴定其抗原性。结果:发现1段与GⅡ.6 VP1区同源性较高的氨基酸序列“MG-D-W”,综合分析提示其可能为GⅡ.6 NoV的抗原模拟表位,且合成的包含“MG-D-W”的多肽可竞争抑制P蛋白与人类组织血型抗原(HBGAs)受体的结合。结论:“MG-DW”是与NoV单链抗体高亲和力的肽段,可能模拟了GⅡ.6 NoV与scFv结合的抗原表位。 展开更多

关键词 诺如病毒 12肽库 抗原模拟表位 单链可变片段抗体

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融合型B细胞淋巴瘤独特型DNA疫苗表达质粒的构建 被引量：1

10

作者 王福旭 张颜 +4 位作者 赵冰 潘崚 张学军 罗建民 董作仁 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2009年第6期1453-1458,共6页

已有研究证实,B细胞淋巴瘤病人自身免疫球蛋白独特型可视为肿瘤特异性抗原用于独特型疫苗。为探究带有细胞因子的融合型独特型肿瘤疫苗是否会提高免疫效果,制备小鼠B细胞型淋巴瘤细胞的独特型单链可变区片段,与免疫佐剂单核细胞趋化因子... 已有研究证实,B细胞淋巴瘤病人自身免疫球蛋白独特型可视为肿瘤特异性抗原用于独特型疫苗。为探究带有细胞因子的融合型独特型肿瘤疫苗是否会提高免疫效果,制备小鼠B细胞型淋巴瘤细胞的独特型单链可变区片段,与免疫佐剂单核细胞趋化因子MCP3融合,同时融合报告基因EGFP,构建融合型独特型淋巴瘤DNA疫苗。用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤细胞株A20的IgVH和IgVL基因,重组PCR法将编码(Gly4Ser)3的核苷酸片段连接两基因,制备scFv片段。用相同PCR方法,选用1段编码NDAQAPKS连接肽连接趋化因子MCP3基因与scFv片段,获得MCP3-scFv融合基因片段。将scFv和MCP3-scFv融合基因片段分别插入真核表达质粒pTARGET,并在融合基因的下游插入报告基因EGFP,构建真核表达质粒pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP。结果表明,成功扩增A20细胞的IgVH和IgVL基因片段及scFv-EGFP、MCP3-scFv-EGFP融合基因片段;酶切鉴定表明,成功制备重组真核表达质粒pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP。结论:成功构建带有鼠源scFv片段、趋化因子MCP3和EGFP融合的独特型抗B细胞淋巴瘤疫苗表达质粒pTARGET/MCP3-scFv-EGFP和pTARGET/scFv-EGFP。所构建的重组表达质粒为下一步的抗B细胞淋巴瘤基因疫苗的体内动物实验奠定了基础。 展开更多

关键词 B细胞淋巴瘤 单链可变区片段 趋化因子 增强型绿色荧光蛋白 独特型DNA疫苗

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细胞因子释放风险潜能评估:一种降低双特异性T细胞接合物在非临床研发中风险的良好手段

11

作者 谢进 张宏峰 +2 位作者 柳华春 潘心红 Renke DAI 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2021年第7期522-530,共9页

双特异性T细胞接合剂(BiTE)具有很好的抗癌特性。然而,潜在的细胞因子释放综合征(CRS)对于所有BiTE而言都是危险的信号。尽管这种毒性被认为与细胞因子释放有关,CRS的作用机制仍然不完全清楚。为进一步深化BiTE临床应用研发,对BiTE进行... 双特异性T细胞接合剂(BiTE)具有很好的抗癌特性。然而,潜在的细胞因子释放综合征(CRS)对于所有BiTE而言都是危险的信号。尽管这种毒性被认为与细胞因子释放有关,CRS的作用机制仍然不完全清楚。为进一步深化BiTE临床应用研发,对BiTE进行CRS风险评估的非临床研究是降低药物研发风险的关键。本综述讨论了CRS的可能机制,特别是包括一些有助于CRS发展的主要因素,如T细胞的激活和白细胞介素的升高。T细胞活化可能只是CRS级联反应的开始,其他类型的细胞也可以极大促进CRS,包括由下游B细胞、单核细胞和内皮细胞触发的连锁反应。可基于CRS级联中的这些组件来设计非临床前风险规避程序。体外细胞因子释放测定与体内小鼠和非人类灵长类动物研究的结合可以预测和减轻临床中的CRS风险。此外,良好的风险规避程序能够为药物候选物的进一步研发提供一些CRS风险区域性排列,并提供足够的信心来选择临床试验首例剂量。 展开更多

关键词 双特异性T细胞接合体 可变片段单链 细胞因子释放综合征

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嵌合抗原受体修饰T细胞真的对卵巢癌有杀伤作用吗?

12

《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第18期F0002-F0002,共1页

卵巢癌的标准治疗方案以外科手术治疗为主，辅以顺铂和紫杉烷联合化疗，中位生存期仅为18个月。因此，亟需寻找更有效的卵巢癌治疗手段。陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院全军临床病理学研究所余时沧教授研究团队以间皮素作为... 卵巢癌的标准治疗方案以外科手术治疗为主，辅以顺铂和紫杉烷联合化疗，中位生存期仅为18个月。因此，亟需寻找更有效的卵巢癌治疗手段。陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院全军临床病理学研究所余时沧教授研究团队以间皮素作为T细胞表面稳定表达可特异性识别肿瘤相关抗原，采用人源化抗人间皮素单链可变区片段，与T细胞活化分子CD3ξ；链及共刺激分子CD28构建嵌合抗原受体融合基因，在保证嵌合抗原受体修饰T细胞特异性识别肿瘤抗原、增强T细胞活化和续存能力、避免脱靶效应的同时，减少了宿主抗异基因体液免疫应答。 展开更多

关键词 T细胞活化 抗原受体 卵巢癌 杀伤作用 嵌合 修饰 第三军医大学 单链可变区片段

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