丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达 被引量：12

1

作者 成军 施双双 +5 位作者 钟彦伟 夏小兵 王刚 王琳 刘妍 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期394-397,共4页

利用分子生物学技术 ,构建表达丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体 (ScFv)的原核表达载体 ,并在大肠杆菌JM 10 9中表达可溶性的HCV core ScFv。以重组的HCV核心蛋白为包被抗原 ,利用噬菌体抗体库的表面展示技术 ,筛选到含... 利用分子生物学技术 ,构建表达丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体 (ScFv)的原核表达载体 ,并在大肠杆菌JM 10 9中表达可溶性的HCV core ScFv。以重组的HCV核心蛋白为包被抗原 ,利用噬菌体抗体库的表面展示技术 ,筛选到含有HCV core ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒 ,经NcoI/NotI酶切鉴定 ,该ScFv基因由 75 0bp组成。将其亚克隆到 pCANTAB5E表达载体中 ,转化大肠杆菌JM10 9,提取质粒进行DNA序列测定 ,符合ScFv的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。IPTG诱导转化的大肠杆菌JM10 9,在其培养上清中获得了可溶性HCV core ScFv的表达。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV core ScFv具有重组HCV核心蛋白的反应活性和特异性。对转化的JM10 9大肠杆菌上清中表达的HCV core ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,证实表达的HCV core ScFv的分子量为 2 8kDa。为应用HCV core ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 核心蛋白 单链可变区抗体 表达

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丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 被引量：5

2

作者 钟彦伟 成军 +5 位作者 王刚 洪源 王琳 李莉 张玲霞 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期28-30,共3页

为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗 HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得可与HCV核心蛋... 为制备抗丙型肝炎病毒核心蛋白的抗独特型单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗 HCV核心蛋白的单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得可与HCV核心蛋白单克隆抗体结合的抗独特型人源单链可变区抗体的噬菌体集落。随机挑选 6 0个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定。获得与HCV核心蛋白单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCV核心蛋白特异性抗 IdscFv的编码序列进行测定分析。结果经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选 ,在随机挑选的 6 0个克隆中 ,有 2 0株克隆ELISA的吸光度(A4 5 0nm)值较高 ,这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应后 ,确定了其中有 6株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆 ,提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA大小为 76 8bp。本实验结果提示用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗 HCV核心蛋白的抗 IdscFv ,为开展用抗 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 核心蛋白 抗独特型人源单链可变区抗体 筛选 鉴定

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丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 被引量：4

3

作者 钟彦伟 成军 +5 位作者 王刚 洪源 王琳 李莉 张玲霞 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期37-39,共3页

为探索新型治疗方法 ,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗HCVNS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术 ,从噬菌体单链可... 为探索新型治疗方法 ,制备抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体 (抗 IdscFv) ,采用噬菌体表面展示技术 ,将抗HCVNS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板 ,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术 ,从噬菌体单链可变区抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,随机挑选 82个克隆 ,利用酶联免疫吸附法 (ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验 ,对其进行免疫学检测和鉴定 ,获得与HCVNS4A单克隆抗体结合活性较强的抗 IdscFv阳性克隆 ,并对HCVNS4A特异性抗 IdscFv的编码基因进行序列测定分析。结果 ,经过筛选 82个克隆中有 4 0株克隆ELISA的吸光度 (A4 5 0nm)值较高 ,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白 (BSA)进行交叉反应 ,确定其中有 7株交叉反应较弱 ,结合 2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果 ,最后确定 1株阳性克隆。提取质粒 ,进行DNA序列测定 ,DNA为 789bp。本实验结果提示 ,用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCVNS4A的抗 IdscFv,为开展用抗 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 NS4A 抗独特型人源单链可变区抗体 筛选 鉴定

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人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选 被引量：4

4

作者 吴国球 刘乃丰 +3 位作者 赵桂琴 范小波 张臣 王明虹 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期464-468,共5页

目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲... 目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。 展开更多

关键词 结缔组织生长因子 噬菌体展示 人源单链可变区片段

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丙型肝炎病毒包膜蛋白E2人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 被引量：3

5

作者 钟彦伟 成军 +2 位作者 施双双 王刚 陈菊梅 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期53-54,共2页

采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的HCV结构蛋白E2为固相包被抗原 ,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得抗原特异性和结合活性较强的HCVE2人源单链可变区抗体 (ScFv)片段 ,片段为 771bp,阳性克... 采用噬菌体表面展示技术 ,以重组的HCV结构蛋白E2为固相包被抗原 ,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得抗原特异性和结合活性较强的HCVE2人源单链可变区抗体 (ScFv)片段 ,片段为 771bp,阳性克隆 ,对其进行免疫学检测 ,并对HCVE2特异性ScFv的编码基因序列进行测定分析。结果筛选得到的HCVE2ScFv片段 (771bp) 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 包膜蛋白E2 人源单链可变区抗体 筛选 鉴定

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抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达 被引量：2

6

作者 王宏 陈丹 +5 位作者 邓宁 向军俭 靳英杰 黄红亮 唐勇 杨红宇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1150-1153,共4页

目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达。方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变... 目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达。方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGFscFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。 展开更多

关键词 BFGF 单克隆抗体 可变区基因 单链抗体 表达

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鼠源性抗人HAAH mAb可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达 被引量：2

7

作者 汪桦 薛小平 +4 位作者 雷迎峰 宋凯 呼延霆 王伟 杨慧 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期467-470,共4页

目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链可变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达。方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-... 目的:从分泌抗人类天冬氨酰基β-羟化酶(HAAH)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞G3/F11中,克隆出鼠源an-ti-HAAH mAb重、轻链可变区基因,构建Anti-HAAH的单链抗体(scFv),并进行scFv基因的蛋白表达。方法:提取杂交瘤细胞G3/F11的总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL基因;再利用重叠延伸PCR(SOE-PCR),通过设计在引物上的linker序列,将VH和VL拼接为完整anti-HAAHscFv基因。将测序正确的scFv基因克隆入pHEN1载体,并利用E.coliHB2151进行蛋白表达;通过SDS-PAGE,Western blot分析其表达状况,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序结果显示,本实验成功地构建出鼠源anti-HAAHVH-linker-VLscFv基因,且VH、VL均具有完整正确的小鼠抗体骨架区和互补决定区结构,所得的scFv基因片段全长744bp,编码248个氨基酸。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,pHEN1-anti-HAAH在E.coliHB2151可表达为Mr约27000的可溶性scFv蛋白,表达量为7.8%。间接ELISA检测显示,可溶性鼠源anti-HAAHscFv蛋白具有较高的抗原结合活性。结论:成功扩增出的鼠源anti-HAAHmAbVH区和VL区基因,并构建为anti-HAAHscFv基因。然后,利用pHEN1载体对anti-HAAHscFv基因进行成功表达,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础。 展开更多

关键词 人类天冬氨酰基β-羟化酶 单链抗体 抗体可变区 单克隆抗体 蛋白表达

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抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达 被引量：1

8

作者 孙元杰 李永明 +6 位作者 刘志佳 张葵 魏玉英 宋朝君 周幸春 金伯泉 杨琨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期69-71,共3页

目的从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达。方法从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用R... 目的从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达。方法从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因;通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv)。将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达。通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性。结果测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸。SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白。间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性。结论制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础。 展开更多

关键词 SEB 抗体可变区 单链抗体 蛋白表达 酶联免疫吸附法

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单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达 被引量：1

9

作者 王福旭 赵冰 +4 位作者 程云会 潘崚 罗建民 张学军 董作仁 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第6期1151-1155,共5页

本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白(Ig)的单链可变区片段(scFv),与单核细胞趋化因子(MCP-3)的基因融合,构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白,制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采... 本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白(Ig)的单链可变区片段(scFv),与单核细胞趋化因子(MCP-3)的基因融合,构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白,制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的IgVH和IgVL基因,重组PCR法用一段编码(Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因,制备scFv片段。用相同PCR方法,选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列,连接scFv与MCP-3基因,获得scFv-MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGLo中,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。测序结果表明分别成功克隆A20细胞的IgVH和IgVL基因,并成功制备了scFv片段和scFv-MCP-3融合基因片段;限制性酶切方法证实,重组pGLo/scFv-MCP-3原核表达质粒中融合基因准确插入。SDS-PAGE电泳分析显示,融合蛋白分子量约65kD,与预期蛋白分子量一致,并且目的蛋白占菌体蛋白的30%。结论本研究成功构建鼠源scFv片段与趋化因子MCP-3融合的独特型B细胞淋巴瘤疫苗表达质粒pGLo/scFv-MCP-3,并实现融合蛋白的初步表达。 展开更多

关键词 独特型疫苗 B细胞淋巴瘤 单链可变区 单核细胞趋化蛋白-3

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给予卵清蛋白表位内化受体DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD)可抑制小鼠食物过敏 被引量：2

10

作者 万冲 吴美英 +4 位作者 张雨晴 邵俊维 骆晴晴 鞠吉雨 徐灵芝 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期391-396,共6页

目的研究卵清蛋白(OVA)表位内化受体DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD)对小鼠食物过敏的预防性治疗作用及可能的机制。方法基于食物过敏模型,将小鼠随机分为单纯对照组、PBS组、100μg DEC205受体抗体单链可变区(scFv DEC)处理组、50μ... 目的研究卵清蛋白(OVA)表位内化受体DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD)对小鼠食物过敏的预防性治疗作用及可能的机制。方法基于食物过敏模型,将小鼠随机分为单纯对照组、PBS组、100μg DEC205受体抗体单链可变区(scFv DEC)处理组、50μg SD处理组、100μg SD处理组,每次接触卵清蛋白(OVA)24 h前给予相应处理。激发后评估小鼠腹泻发生情况,测肛温,ELISA检测血清中OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a以及白细胞介素4(IL⁃4)水平,HE染色观察空肠组织嗜酸性粒细胞浸润情况,甲苯胺蓝染色观察肥大细胞浸润情况。分离培养未成熟骨髓来源的树突状细胞(BMDC),分别以10 ng/mL脂多糖(LPS)、50 ng/mL胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、1000 ng/mL scFv DEC蛋白、(10、100、1000)ng/mL SD蛋白刺激培养24 h,检测上清中IL⁃10水平。结果与PBS组相比,预防性给予SD蛋白,发生腹泻的小鼠数量明显减少,肛温差显著减小,血清OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a以及IL⁃4水平显著降低;空肠组织嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润显著减少,SD体外刺激BMDC培养上清IL⁃10水平显著升高。结论SD通过促进树突状细胞的免疫耐受减轻实验性食物过敏反应。 展开更多

关键词 树突状细胞 食物过敏 DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD) 白细胞介素10

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人源性抗SARS-CoV-2单链抗体文库的构建及广谱中和抗体的筛选与鉴定

11

作者 尹慧敏 吕海 +3 位作者 迟莹 刘静娴 焦永军 卫平民 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第2期154-160,共7页

目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA... 目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板构建人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库;利用噬菌体展示技术筛选对SARS-CoV-2 S蛋白具有特异性的scFv抗体。通过序列分析和人源IgG抗体表达,合成IgG全抗体,并评估其对SARS-CoV-2的结合能力及中和活性。结果成功构建了库容量为1.56×10^(7)CFU的SARS-CoV-2人源性scFv抗体文库,筛选出两种特异性scFv抗体;并将scFv抗体表达成IgG形式的全抗体(IgG-A10和IgG-G6),其中IgG-A10对SARS-CoV-2原始株(WT)和奥密克戎亚型变异毒株XBB(XBB)毒株均具有较好中和活性,对奥密克戎BA.2.86变异株的第二代亚分支JN.1(JN.1)毒株中和效果一般。结论本研究从康复者外周血中成功构建了人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库,并筛选表达出具有中和活性的抗SARS-CoV-2 IgG抗体,为SARS-CoV-2感染的预防、诊断和治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 SARS-CoV-2 单链可变片段(scfv) 噬菌体展示技术 中和抗体

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以反向PCR扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可变区基因 被引量：5

12

作者 王莹 李旭 陈葳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期489-490,共2页

关键词 单链抗体 重链 可变区 反向PCR 宫颈癌

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抗黄曲霉毒素单链抗体基因的克隆与表达 被引量：3

13

作者 李鑫 李培武 +2 位作者 张奇 张文 李园园 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期528-532,共5页

为降低黄曲霉毒素抗体制备成本,在已有的能分泌抗黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞系8F6的基础上,成功克隆得到了该单克隆抗体的重链(VH)和轻链可变区(VL)基因片段。通过重叠延伸PCR的方法将轻、重链可变区基因连接,并引入连接肽(Link... 为降低黄曲霉毒素抗体制备成本,在已有的能分泌抗黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞系8F6的基础上,成功克隆得到了该单克隆抗体的重链(VH)和轻链可变区(VL)基因片段。通过重叠延伸PCR的方法将轻、重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB 5E上,使单链抗体以噬菌体展示形式在大肠杆菌TG1中表达。间接竞争ELISA方法检测到该ScFv对黄曲霉毒素B1的抑制率(IC50)值为0.57ng/mL,表明该单链抗体与亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性,且具有很高灵敏度。 展开更多

关键词 黄曲霉毒素 抗体可变区 单链抗体

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融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析 被引量：3

14

作者 高国辉 王金丹 +5 位作者 黄奇迪 杨纪峰 杨水兵 包兵兵 张羽 胡孝渠 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期1034-1040,共7页

目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达... 目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。 展开更多

关键词 抗HER2单链抗体可变区片段 绿色荧光蛋白 融合基因表达

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抗大肠癌噬菌体人单链抗体的初步鉴定及序列分析 被引量：2

15

作者 朱建高 胡锦跃 +4 位作者 李官成 李跃辉 周国华 孙去病 李小玲 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第2期95-98,共4页

目的 :对抗大肠癌细胞的单克隆噬菌体单链抗体进行初步鉴定和测序分析。方法 :采用细胞ELISA ,免疫组化 ,DNA序列测定和计算机分析方法 ,对 5个单克隆噬菌体抗体 (CH2 73,CH2 0 5 ,CH2 0 9,CHA12 ,CH72 3)进行初步鉴定和序列分析。结果... 目的 :对抗大肠癌细胞的单克隆噬菌体单链抗体进行初步鉴定和测序分析。方法 :采用细胞ELISA ,免疫组化 ,DNA序列测定和计算机分析方法 ,对 5个单克隆噬菌体抗体 (CH2 73,CH2 0 5 ,CH2 0 9,CHA12 ,CH72 3)进行初步鉴定和序列分析。结果 :5个抗体均对人大肠癌细胞、人胚肾上皮细胞和其它某些人肿瘤细胞反应 ,也与人正常肝细胞有弱阳性反应 ,但不与鼠源性的癌细胞和正常细胞反应。细胞免疫组化进一步证实了ELISA结果的正确性。大肠癌免疫组化对大肠癌组织有特异性的结合反应 ,而不与正常大肠组织反应。测序结果为CH2 73ScFv全长 732bp ;V ,D ,J分别属于VH3 30 D1 2 6 JH3 linker V1 13 JL2 ,GenBank序号为AY0 2 8777和AY0 2 8996 ;CH2 0 5全长 36 6bp ,V ,D ,J分别VH1 4 6 D6 13 JH3,GenBank序号为AF35 936 5 ;CH2 0 9,CHA12和CH72 3的ScFv基因完全相同 ,全长 72 3bp ,其VH DH JH与CH2 73ScFv基因中的VH DH JH 完全一致 ,V ,D ,J分别属于VH3 30 D1 2 6 JH3 linker L2 Jκ2 ,GenBank序号为AF36 3774。结论 :噬菌体抗体具有结合人大肠癌组织和细胞的活性 。 展开更多

关键词 抗大肠癌噬菌体 单链抗体 初步鉴定 序列分析 免疫组化 大肠癌 免疫球蛋白可变区基因

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一种可溶性单抗ScFv片段的表达及鉴定 被引量：1

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作者 钟小林 高会广 +1 位作者 吉清 黄刚 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第8期691-694,共4页

目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 ... 目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 15 1进行可溶性抗体表达 ,经点印迹和Western印迹检测可溶性单抗ScFv的表达水平 ,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。用双脱氧法对组成ScFvDNA的VH和VLDNA进行序列测定。结果　可溶性MC3ScFv获得了成功表达 ,表达产物主要位于周质腔中 ,其分子量约为 3 2× 10 3。来自所获得的 3个克隆周质提取物均能抑制单抗与高水平表达MC3结合抗原的AGS细胞结合 ,抑制率分别为 41.19%、3 6.89%、3 3 .77%。对ScFv的VH和VLDNA的测序结果表明所获抗体的可变区基因属IgG1亚族 ,κ型。结论　利用大肠杆菌HB2 15 1成功表达了具有抗原结合活性的MC3ScFv ,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。 展开更多

关键词 结肠癌 单克隆抗体 单链可变区片段 噬菌体

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鸡源Bursin-ScFv噬菌体展示文库的构建及初步筛选 被引量：1

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作者 邬向东 曲悦 +2 位作者 谌南辉 王萍 何后军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期488-493,共6页

本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩... 本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩增出该抗体的可变区VH和VL基因(大小分别约为370和320 bp)。通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,将ScFv DNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素独特型抗体全套单链噬菌体抗体库。并测得该库容量约为5×105,噬菌体中ScFv基因的插入率为80%,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为1011PFU/mL的初级噬菌体抗体库。用抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛,出现特异性富集。经ELISA、动物试验表明所筛选的5个阳性克隆可与抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)特异性结合,并能促进抗体的生产。 展开更多

关键词 三肽囊素 抗独特型抗体 可变区 重链 轻链 单链抗体 单克隆抗体 噬菌体抗体库

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老年痴呆噬菌体抗体库的构建及抗Aβ肽单链抗体的筛选 被引量：1

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作者 赵振富 苏雪莹 +3 位作者 初国良 徐杰 汪华侨 姚志彬 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期732-734,737,共4页

目的:构建人源性的老年痴呆(AD)噬菌体抗体库,筛选1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv)。方法:利用噬菌体展示技术,用20个AD患者的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ40为靶,挑选出77个阳性抗... 目的:构建人源性的老年痴呆(AD)噬菌体抗体库,筛选1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv)。方法:利用噬菌体展示技术,用20个AD患者的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一个抗AβscFv-H1,并对其重链和轻链可变区基因进行测序分析。利用预吸附实验及竞争性ELISA测定该抗体对Aβ40的特异性及结合位点。结果:成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106。从库中筛选出1株抗Aβ40的单链噬菌体抗体-H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列。预吸附及竞争性ELISA证实该抗体对Aβ40的结合表位位于蛋白氨基端的1到16个氨基酸内。结论:利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性scFv,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 噬菌体展示抗体库 单链可变区抗体 Β淀粉样蛋白

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抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备 被引量：1

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作者 孙元杰 李永明 +5 位作者 张葵 魏玉英 宋朝君 周幸春 金伯泉 杨琨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期403-406,共4页

目的构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定。方法设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb)FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细... 目的构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定。方法设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb)FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化。采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析。结果成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸。PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功。转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白。经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90%以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性。结论成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体。 展开更多

关键词 B型葡萄球菌肠毒素 重链和轻链可变区基因 单链抗体 原核表达 ELISA WESTERN BLOT

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三肽囊素抗独特型ScFv噬菌体展示文库的构建 被引量：1

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作者 邬向东 谌南辉 +3 位作者 李麟 何后军 袁汉英 王萍 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期482-485,共4页

利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得... 利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素抗独特型抗体全套单链噬菌体抗体库,并将该抗体库展示在噬菌体表面,以利用噬菌体展示技术的强大筛选能力筛选出与三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-ScFv)。 展开更多

关键词 三肽囊素 抗独特型抗体 可变区重链和轻链基因 单链抗体 噬菌体抗体库

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