目的原代乳鼠心肌细胞为终末期的分化细胞,常规的质粒转染效率低下。受体相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140,RIP140)目的基因长达3.5kb,为研究RIP140蛋白在非增殖型的心肌细胞表达情况,需要寻找一种更好的过表达系统。...目的原代乳鼠心肌细胞为终末期的分化细胞,常规的质粒转染效率低下。受体相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140,RIP140)目的基因长达3.5kb,为研究RIP140蛋白在非增殖型的心肌细胞表达情况,需要寻找一种更好的过表达系统。方法 RIP140基因全长序列克隆入p Ad Track-CMV穿梭载体中,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体p Ad Easy^(-1)进行同源重组。经酶切及测序验证的阳性重组克隆转染入AD293细胞中进行病毒的包装与扩增。采用TCID50法测定病毒滴度、CCK-8试剂盒分析腺病毒对心肌细胞活力的影响。采用Western blot鉴定RIP140蛋白在心肌细胞中的表达情况。结果测序分析结果表明RIP140的全长序列正确克隆到Ad Easy TM腺病毒系统中。AdRIP140、Ad-GFP的病毒滴度分别为1011.3和1011.7PFU·m L^(-1)。腺病毒感染复数在200以下时,对心肌细胞活力无影响。绿色荧光及Western blot分析显示Ad-RIP140感染心肌细胞12 h,RIP140表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了RIP140全长序列的腺病毒载体,并使其蛋白有效表达于心肌细胞中,这将有助于后续进行RIP140在心肌细胞中的作用的研究。展开更多
旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病...旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。展开更多
文摘目的原代乳鼠心肌细胞为终末期的分化细胞,常规的质粒转染效率低下。受体相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140,RIP140)目的基因长达3.5kb,为研究RIP140蛋白在非增殖型的心肌细胞表达情况,需要寻找一种更好的过表达系统。方法 RIP140基因全长序列克隆入p Ad Track-CMV穿梭载体中,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体p Ad Easy^(-1)进行同源重组。经酶切及测序验证的阳性重组克隆转染入AD293细胞中进行病毒的包装与扩增。采用TCID50法测定病毒滴度、CCK-8试剂盒分析腺病毒对心肌细胞活力的影响。采用Western blot鉴定RIP140蛋白在心肌细胞中的表达情况。结果测序分析结果表明RIP140的全长序列正确克隆到Ad Easy TM腺病毒系统中。AdRIP140、Ad-GFP的病毒滴度分别为1011.3和1011.7PFU·m L^(-1)。腺病毒感染复数在200以下时,对心肌细胞活力无影响。绿色荧光及Western blot分析显示Ad-RIP140感染心肌细胞12 h,RIP140表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了RIP140全长序列的腺病毒载体,并使其蛋白有效表达于心肌细胞中,这将有助于后续进行RIP140在心肌细胞中的作用的研究。
文摘旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。
