巢式实时荧光定量PCR检测RA患者外周血单个核细胞TGF-βRⅡmRNA

1

作者 刘春艳 王云 王礼文 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期61-64,共4页

目的建立检测人外周血单个核细胞(PBMC)中转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)mRNA实时荧光定量PCR方法,并探讨其在RA中的临床意义。方法跨内含子设计外引物,并根据扩增片段,设计一对内引物,采用巢式实时荧光定量PCR(nested-real-time-P... 目的建立检测人外周血单个核细胞(PBMC)中转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)mRNA实时荧光定量PCR方法,并探讨其在RA中的临床意义。方法跨内含子设计外引物,并根据扩增片段,设计一对内引物,采用巢式实时荧光定量PCR(nested-real-time-PCR)方法。首次扩增采用减少引物、酶浓度、及循环次数的方法保持扩增片段的高度特异性,再进行第二次PCR扩增作实时荧光定量检测,同时以β-actin作内参,二者比值作为TGF-βRⅡ表达水平指标。结果Ct值和模板起始浓度对数值之间具有良好的线性关系(r2=0.999);检测最低浓度可达101拷贝。RA患者组和健康对照组的TGF-βRⅡ与β-actin的比值分别为0.45±0.11和0.37±0.10,两者有显著差异(P<0.01);RA治疗前、后两者比值分别为0.46±0.11和0.40±0.11,治疗后下降13.0%。结论巢式实时灾光定量PCR检测PBMC中TGF-βRⅡmRNA的方法简便,特异,重复性好,可信度高,其表达水平对RA具有一定的诊断价值,并可作为评价该病治疗效果的一种方法。 展开更多

关键词 TGF-βRⅡ 类风湿关节炎 巢式实时荧光定量pcr 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

半巢式RT-Realtime PCR方法检测藜草花叶病毒 被引量：2

2

作者 贺丽娜 李金庆 +6 位作者 厉艳 粟智平 封立平 鲁闽 段效辉 王颖 刘宁 《安徽农业科学》 CAS 2019年第2期194-196,共3页

[目的]根据藜草花叶病毒(SoMV)全基因组中多聚蛋白质基因序列保守区,分别设计2套TaqMAN探针和引物,建立半巢式实时荧光PCR检测SoMV的新方法。[方法]提取病毒核酸进行反转录操作合成cDNA,依据设计好的2套TaqMAN探针和引物,分别进行实时荧... [目的]根据藜草花叶病毒(SoMV)全基因组中多聚蛋白质基因序列保守区,分别设计2套TaqMAN探针和引物,建立半巢式实时荧光PCR检测SoMV的新方法。[方法]提取病毒核酸进行反转录操作合成cDNA,依据设计好的2套TaqMAN探针和引物,分别进行实时荧光PCR特异性与灵敏度检测,并进行2套引物探针的扩增效率对比试验。[结果]方法特异性强,灵敏度高达0.4 fg/μL植物总RNA,2套引物探针的扩增效率试验对比结果显示扩增效率几乎完全一样。[结论]该方法适用于藜草花叶病毒的检疫鉴定。 展开更多

关键词 藜草花叶病毒 半巢式实时荧光pcr 检测

在线阅读 下载PDF 职称材料

三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较 被引量：11

3

作者 程保平 彭埃天 +2 位作者 宋晓兵 凌金锋 陈霞 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期106-110,共5页

为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)的检测效果,首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度,结果发现:3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PC... 为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)的检测效果,首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度,结果发现:3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。运用3种检测方法对广东5个柑橘品种上的189个黄龙病疑似病样进行检测,结果发现:黄龙病检出率依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。研究表明:常规PCR适合以较低成本大规模检测黄龙病;实时荧光定量PCR具有最大的检测灵敏度;巢式PCR检测技术同时具有前两者的一些优点,但操作较复杂,适合技术熟练的研究者使用。 展开更多

关键词 柑橘黄龙 病常规pcr 巢式pcr 实时荧光定量pcr 比较研究

在线阅读 下载PDF 职称材料

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析 被引量：2

4

作者 王珊珊 柳学周 +5 位作者 史宝 温海深 徐永江 李晓晓 刘芝亮 王妍妍 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2013年第6期15-23,共9页

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA，利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp，开放阅读框为393bp，编码130个氨基酸（GenBank序列登... 从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA，利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp，开放阅读框为393bp，编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明，半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％，与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树，获得的进化树表明，半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类，亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明，FSHmRNA除在垂体中大量表达外，其他组织也有表达，尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达，暗示FSH可能具有广泛的生理功能。 展开更多

关键词 半滑舌鳎 促滤泡激素基因 CDNA克隆 组织表达 实时荧光定量pcr

在线阅读 下载PDF 职称材料

膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征 被引量：1

5

作者 李晓妮 柳学周 +2 位作者 史宝 徐永江 张金勇 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2017年第1期25-33,共9页

通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表... 通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达。对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高。HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控。对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显。原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达。本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据。 展开更多

关键词 膜孕激素受体 半滑舌鳎 原位杂交 免疫组化 WESTERN BLOTTING 实时荧光定量pcr

在线阅读 下载PDF 职称材料

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)miR-223的表达特征及免疫应答分析 被引量：2

6

作者 颜慧 曾艳 +4 位作者 公光业 陈亚东 陈松林 刘洋 沙珍霞 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2015年第2期37-44,共8页

microRNA(mi RNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。本研究使用荧光实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR)方法,研究了mi RNA-223(mi... microRNA(mi RNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。本研究使用荧光实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR)方法,研究了mi RNA-223(mi R-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式。结果显示,mi R-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低。鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达。鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织mi R-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达。其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调。用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后mi R-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达。研究结果表明,mi R-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程。本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制。 展开更多

关键词 半滑舌鳎 微小核糖核酸 鳗弧菌 荧光实时定量pcr 表达 免疫

在线阅读 下载PDF 职称材料

PCR技术在牛羊肉制品成分鉴定及掺假鉴别中的应用 被引量：1

7

作者 黄惠敏 张东升 李岳桦 《食品安全导刊》 2016年第4X期26-27,共2页

近年来诸如"马肉丑闻""挂羊头卖狗肉"事件时有发生,食品掺假引发了公众对食品安全的担忧以及各国政府的关注。近年来普通PCR技术、实时荧光PCR法、多重PCR等技术快速发展,在肉制品成分鉴定及掺假鉴别的研究中发挥... 近年来诸如"马肉丑闻""挂羊头卖狗肉"事件时有发生,食品掺假引发了公众对食品安全的担忧以及各国政府的关注。近年来普通PCR技术、实时荧光PCR法、多重PCR等技术快速发展,在肉制品成分鉴定及掺假鉴别的研究中发挥了越来越大的作用,成为研究热点之一。本文对PCR技术在牛羊肉制品的成分鉴定及掺假鉴别中的研究进展进行了综述。 展开更多

关键词 成分鉴定 pcr技术 实时荧光 食品掺假 马肉 定性检测 DNA 半保留复制链 畜肉 原料肉

在线阅读 下载PDF 职称材料

大剂量抗氧化剂对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及机制

8

作者 王冰 李宏亮 +4 位作者 杨文英 萧建中 杜瑞琴 白秀平 潘琳 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2007年第6期575-580,共6页

目的:探讨大剂量抗氧化剂-N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及可能机制。方法:将59只8周龄SD大鼠随机分为正常饲料组(NC组)、高脂饲料组(HF组)和高脂+NAC组(NAC组)。饲养20周,(1)测血浆... 目的:探讨大剂量抗氧化剂-N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及可能机制。方法:将59只8周龄SD大鼠随机分为正常饲料组(NC组)、高脂饲料组(HF组)和高脂+NAC组(NAC组)。饲养20周,(1)测血浆及胰腺组织丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;(2)正常血糖高胰岛素钳夹实验,评价外周组织胰岛素抵抗程度;(3)胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能;(4)实时荧光定量PCR方法比较各组大鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)和葡萄糖转运子-2(Glut-2)mRNA表达的变化。结果:(1)HF组血浆及胰腺MDA水平明显高于NC组,GSH水平低于NC组,NAC可以改善以上变化;(2)HF组葡萄糖输注率(GIR)比NC组降低(P<0.01),用NAC后GIR明显改善(P<0.01);HF组葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能下降,用NAC后可逆转上述变化;(3)HF组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2mRNA表达降低42.3%、28.1%、22.9%(P均<0.05);NAC组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2 mRNA表达与HF组相比增加40.2%、30.2%,19.1%(P均<0.05)。结论:大剂量抗氧化干预治疗能改善胰岛细胞胰岛素信号传导,逆转高脂饲养导致的大鼠胰岛细胞分泌功能紊乱,其机制可能与NAC纠正机体氧化及抗氧化失衡有关。 展开更多

关键词 乙酰半胱氨酸 胰岛/细胞学 胰岛素/分泌 N-乙酰半胱氨酸 胰岛β细胞 实时荧光定量pcr

在线阅读 下载PDF 职称材料

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞IL-21R mRNA的检测及其临床意义 被引量：4

9

作者 崔玲玲 王礼文 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期57-60,共4页

目的建立检测类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)IL-21R mRNA的巢式实时荧光定量PCR的方法,研究IL-21R mRNA在RA PBMC中的表达水平并探讨其临床意义。方法根据IL-21R mRNA序列,跨内含子设计外引物,采用巢式实时荧光定量PCR方... 目的建立检测类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)IL-21R mRNA的巢式实时荧光定量PCR的方法,研究IL-21R mRNA在RA PBMC中的表达水平并探讨其临床意义。方法根据IL-21R mRNA序列,跨内含子设计外引物,采用巢式实时荧光定量PCR方法。首次扩增以增加原始模板浓度,并以减少引物、酶的浓度及循环次数的方法保持扩增片段的特异性,再以首次扩增产物为模板,进行二次PCR扩增作实时荧光定量检测;以β-actin作内参,以二者比值作为IL-21R mR-NA表达水平的指标。结果60例RA患者与30例健康人对照相比,RA患者组IL-21R mRNA表达上调(P<0.01);将RA患者关节功能分级作IL-21R mRNA表达水平比较,Ⅰ级、Ⅱ级相比无显箸差异(P(0.05);Ⅰ级、Ⅱ级分别与Ⅲ级以上相比,差异显著(P(0.01);RA活动期IL-21R mRNA水平较非活动期增高,治疗后IL-21R mRNA的表达明显下降,治疗前后比较有显著差异(P<0.01)。结论IL-21R mRNA在RA患者PBMC中高表达,其表达水平对RA的诊断和治疗具有重要的参考价值。本文建立的检测方法重复性好,敏感且特异,可作为一种常规检测手段应用于临床。 展开更多

关键词 IL-21R 类风湿关节炎 巢式实时荧光定量pcr 外周血单个核细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

脂多糖对奶牛输卵管上皮细胞环氧合酶-2基因表达的调控作用 被引量：1

10

作者 王秀明 毛伟 +2 位作者 曹金山 董至恒 刘博 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第6期11-17,共7页

本试验旨在探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对奶牛输卵管上皮细胞环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因表达的影响,阐明LPS对奶牛输卵管上皮细胞COX-2基因表达的调控机制。采用机械法及胰酶消化法分离培养奶牛输卵管上皮细胞;分... 本试验旨在探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对奶牛输卵管上皮细胞环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因表达的影响,阐明LPS对奶牛输卵管上皮细胞COX-2基因表达的调控机制。采用机械法及胰酶消化法分离培养奶牛输卵管上皮细胞;分别将LPS、吲哚美辛、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作用于体外培养的奶牛输卵管上皮细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测LPS对奶牛输卵管上皮细胞COX-2基因表达的调控作用。结果显示,不同浓度的LPS能显著促进输卵管上皮细胞COX-2mRNA的表达(P<0.05),且具有浓度依赖性;LPS作用2h时COX-2mRNA的表达量最高,随之表达量逐渐下降到正常水平;NAC能显著抑制LPS诱导的COX-2mRNA表达(P<0.05)。结果表明,LPS能通过NF-κB途径上调奶牛输卵管上皮细胞COX-2mRNA表达量。 展开更多

关键词 脂多糖 输卵管上皮细胞 环氧合酶-2 吲哚美辛 N-乙酰半胱氨酸 实时荧光定量pcr

在线阅读 下载PDF 职称材料

慢性乙型肝炎患者基因型以及其病毒载量前C区突变的研究

11

作者 朱晓岚 潘小平 《浙江临床医学》 2006年第8期850-851,共2页

关键词 HBV基因型 前C区突变 病毒载量 慢性乙型肝炎患者 基因组DNA 慢性病毒性肝炎 DNA序列分析 巢式pcr技术 乙型肝炎病毒 实时荧光定量

在线阅读 下载PDF 职称材料