人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建 被引量：3

1

作者 杨湘越 兰小鹏 +4 位作者 冯福英 吴文冰 钟智强 廖剑 朱忠勇 《实用医学杂志》 CAS 2006年第22期2575-2577,共3页

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提... 目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体。方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,PCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础。 展开更多

关键词 干燥综合征 毕赤酵母 分泌型表达载体

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hsBLyS分泌型表达载体构建及CHO表达 被引量：1

2

作者 吴海涛 胡云龙 +3 位作者 刁振宇 金丽娜 李洁 张双全 《南京师大学报（自然科学版）》 CAS CSCD 2004年第2期81-86,共6页

本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突... 本实验引物延伸合成人红细胞生成素信号肽序列 ;信号肽序列和人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (hu mansolubleBLymphocyteStimulator,hsBLyS)基因重叠延伸拼接成融合基因 ;融合基因插入pcDNA3、pcDNA3 1、pEFneo质粒 ;信号肽引物设计时 ,突变同义密码 ,最终重组质粒成为分泌表达质粒 ;磷酸钙共沉淀将表达质粒和标志质粒pSV dhfr,共转染CHO—dhfr- 细胞 ;选择培养液筛选 ,氨甲喋呤扩增表达 ,获稳定表达rhsBLyS细胞株 ;ELISA检测浓缩表达上清 ,结果表明 :rhsBLyS表达量由 0 13 μg/mL上升至 0 5 5 μg/mL . 展开更多

关键词 HSBLYS CHO 基因表达 信号肽 分泌型表达载体 免疫调节因子

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Annexin32酵母分泌型表达载体的构建及其高拷贝转化子的快速筛选 被引量：1

3

作者 杨湘越 武圣明 +1 位作者 陈蕊雯 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期695-696,共2页

关键词 Annexin32 酵母分泌型表达载体 构建 高拷贝转化子 快速筛选 毕赤酵母 G418抗性筛选

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应用PCR重组技术构建大肠杆菌分泌型表达载体 被引量：1

4

作者 黄仪秀 陈杰鹏 +3 位作者 毕群 李斯明 张磊 朱圣庚 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期642-645,共4页

应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点... 应用ＰＣＲ重组技术，对大肠杆菌分泌型表达载体ｐＩＮ－ⅢｏｍｐＡ进行改建，除去原载体的ＨｉｎｄⅢ位点，将信号肽序列末端两个密码子ＣＡＧＧＣＣ改为ＣＡＡＧＣＴ，从而引入一个新的ＨｉｎｄⅢ位点，并在其下游接上一段多克隆位点序列。改建后的载体可用于直接插入外源ＤＮＡ编码序列，表达产物在分泌过程中被切除信号肽而成为天然有活性的蛋白质，操作十分简便。 展开更多

关键词 大肠杆菌 分泌型表达载体 聚合酶链反应

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猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达 被引量：3

5

作者 徐彦召 张彦明 +4 位作者 何雷 唐青海 代晨 王静 杨小云 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第5期7-11,共5页

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pS... 【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 展开更多

关键词 猪瘟病毒囊膜蛋白 猪脐静脉血管内皮细胞 分泌型真核表达载体 真核表达

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一种酿酒酵母组成型分泌表达载体的构建及应用

6

作者 王国平 欧阳蓓 +2 位作者 胡紫艳 刘启铃 赵喜华 《江西师范大学学报(自然科学版)》 北大核心 2024年第5期509-513,共5页

该文利用重叠延伸PCR和无缝分子克隆技术构建酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21,该载体由酿酒酵母组成型分泌表达组件(翻译延伸因子1组成型启动子、α因子N-末端分泌信号肽DNA序列和乙醇脱氢酶2终止子所组成)、2μ复制子、大肠杆菌复制... 该文利用重叠延伸PCR和无缝分子克隆技术构建酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21,该载体由酿酒酵母组成型分泌表达组件(翻译延伸因子1组成型启动子、α因子N-末端分泌信号肽DNA序列和乙醇脱氢酶2终止子所组成)、2μ复制子、大肠杆菌复制元件以及URA3筛选标记所组成.将草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶与pYAT21连接并转化到酿酒酵母中,其发酵上清液粗酶活达到106.8 U·mL^(-1).酿酒酵母组成型分泌表达载体pYAT21可应用于异源蛋白的组成型分泌表达. 展开更多

关键词 酿酒酵母 组成型分泌表达载体 异源蛋白

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人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达 被引量：2

7

作者 董燕 王捷 +2 位作者 杨连生 张宏斌 郑文岭 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第1期26-29,共4页

以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特... 以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特异性抗原 展开更多

关键词 人骨唾液酸蛋白 巴斯德毕赤酵母 基因表达 分泌型表达载体 PCR方法 抗原-抗体反应

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小鼠CCL2基因毕赤酵母表达载体的构建及鉴定 被引量：2

8

作者 王东 李海军 高剑峰 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第4期33-35,共3页

从小鼠肝脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增小鼠CCL2基因序列,构建小鼠CCL2cDNA毕赤酵母表达载体,并进行鉴定及序列测定。结果表明,克隆获得的480 bp片段与GenBank里登录号为AF065929和AF065930的cDNA序列完全一致,将目的基因正确... 从小鼠肝脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增小鼠CCL2基因序列,构建小鼠CCL2cDNA毕赤酵母表达载体,并进行鉴定及序列测定。结果表明,克隆获得的480 bp片段与GenBank里登录号为AF065929和AF065930的cDNA序列完全一致,将目的基因正确插入毕赤酵母表达载体pPICZαA分泌信号肽下游。为大量获得小鼠趋化因子CCL2,以及对其生物学功能的研究奠定了试验基础。 展开更多

关键词 CCL2 毕赤酵母 分泌型表达载体

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猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析

9

《今日畜牧兽医》 2009年第9期67-67,共1页

将猪流行性腹泻病毒（PEDV）纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中，构建了重组表达载体pPG-sl，将其电转化干酪乳杆菌Lcasei393，获得了表达PEDVsl蛋白的重组乳酸菌杆菌。重组杆菌诱导后，经westernblot、间接ELISA... 将猪流行性腹泻病毒（PEDV）纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中，构建了重组表达载体pPG-sl，将其电转化干酪乳杆菌Lcasei393，获得了表达PEDVsl蛋白的重组乳酸菌杆菌。重组杆菌诱导后，经westernblot、间接ELISA实验表明，目的蛋白获得了分泌表达。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 干酪乳杆菌 分泌表达 S1蛋白 免疫原性 重组表达载体 分泌型表达载体 间接ELISA

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人纤溶酶原Kringle5区的基因克隆的表达及纯化 被引量：7

10

作者 尹桂芝 李彪 +4 位作者 张一帆 尤蓓 赵龙 陆林 于金德 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第2期151-154,共4页

目的克隆人纤溶酶原Kringle5 (K5 )区基因 ,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定。方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因 ,构建K5的原核表达载体pET 2 2b(+) K5 6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+ -树脂亲和层... 目的克隆人纤溶酶原Kringle5 (K5 )区基因 ,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定。方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因 ,构建K5的原核表达载体pET 2 2b(+) K5 6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+ -树脂亲和层析进行纯化 ,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性。结果经PCR成功扩增出了 2 4 3bp的K5区基因 ,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET 2 2b(+) ,重组质粒在BL2 1中成功表达出分子量为 14 0 0 0的蛋白质 ,纯化后的蛋白纯度达95 % ,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能 ,K5蛋白浓度为 4 μg/mL时抑制率达 5 0 %。 结论纤溶酶原K5的成功克隆。 展开更多

关键词 分泌型表达载体 纯化 ET 血管内皮细胞 基因克隆 肿瘤 扩增 人纤溶酶原 IPTG cDNA库

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地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达 被引量：2

11

作者 蔡恒 陈忠军 +1 位作者 路福平 杜连祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期15-18,共4页

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku... 用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。 展开更多

关键词 蛋白表达 酶基因 大肠杆菌 扩增 克隆 UC 核酸序列 地衣芽孢杆菌 分泌型表达载体 SDS-PAGE分析

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表达人卵泡抑素的毕赤氏巴斯德酵母工程菌的构建 被引量：1

12

作者 尤汉宁 袁汉英 +4 位作者 吕红 高卜渝 陈源文 李育阳 李定国 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第2期107-111,共5页

目的在P .pastoris中分泌表达人卵泡抑素基因。方法采用PCR法扩增目的基因FS2 88片段 ,将其亚克隆入pPIC9,构建pPIC9 FS2 88,DNA序列测定验证后 ,将pPIC9 FS2 88采用BamHⅠ和SalⅠ双酶切 ,回收小片段 ,连接pPIC9K ,构建重组分泌型表达载... 目的在P .pastoris中分泌表达人卵泡抑素基因。方法采用PCR法扩增目的基因FS2 88片段 ,将其亚克隆入pPIC9,构建pPIC9 FS2 88,DNA序列测定验证后 ,将pPIC9 FS2 88采用BamHⅠ和SalⅠ双酶切 ,回收小片段 ,连接pPIC9K ,构建重组分泌型表达载体pPIC9K FS2 88,电穿孔法转化SMD116 8,G4 18筛选多拷贝转化子 ,转化子发酵后 ,取上清液进行SDS PAGE和Westernblot检测重组蛋白表达。结果成功构建了重组分泌型表达载体pPIC9K FS2 88和工程菌株SMD116 8 FS2 88,SDS PGAE显示工程菌发酵上清液在 5 0 0 0 0 ～6 0 0 0 0处有弥散条带 ,并且与Westernblot结果相符。结论工程菌SMD116 8 FS2 展开更多

关键词 FS 人卵 卵泡抑素 分泌型表达载体 上清液 构建 PCR法 转化子 工程菌 分泌表达

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山羊痘病毒P32基因的克隆及毕赤酵母中的表达

13

作者 田启会 祁光宇 杨织瑞 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第6期31-36,共6页

将人工优化合成的山羊痘病毒P32基因和表达载体p PIC9K同时双酶切后相连,构建p PIC9K-IL-2重组表达载体。将线性化的载体p PIC9K-P32电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,经G418抗性梯度筛选,获得多拷贝... 将人工优化合成的山羊痘病毒P32基因和表达载体p PIC9K同时双酶切后相连,构建p PIC9K-IL-2重组表达载体。将线性化的载体p PIC9K-P32电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,经G418抗性梯度筛选,获得多拷贝重组菌株,甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot。SDS-PAGE电泳显示出相对分子质量约为30 k Da目的蛋白表达条带,Western blot分析表明表达的蛋白具有反应原性。本研究成功构建载体p PIC9K-P32,并且P32基因已整合到酵母基因组中,为亚单位疫苗和鉴别诊断试剂奠定了基础。 展开更多

关键词 羊痘病毒 P32基因 毕赤酵母 分泌型表达载体 诱导表达 SDS-PAGE Western BLOT

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透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母菌体密度及表达的影响

14

作者 张玉军 孔浩 王斌 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期88-91,共4页

将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达。转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAG... 将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达。转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,摇瓶发酵试验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达。 展开更多

关键词 毕赤酵母 分泌型表达载体 透明颤菌血红蛋白 腈水解酶

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地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化方法 被引量：10

15

作者 唐雪明 邵蔚蓝 +2 位作者 王正祥 方惠英 诸葛健 《无锡轻工大学学报（食品与生物技术）》 CSCD 北大核心 2002年第5期460-463,共4页

通过体外处理诱导地衣芽孢杆菌产生感受态性能 ,同时调整参数 ,建立了感受态细胞对质粒 pAPR的高效电转化方法 .当质粒DNA为 1.5 μg/mL、转化时电压为175 0V时 ,可得到 2 6 1个转化子 ,经鉴定均为阳性克隆子 .此为以芽孢杆菌为宿主进... 通过体外处理诱导地衣芽孢杆菌产生感受态性能 ,同时调整参数 ,建立了感受态细胞对质粒 pAPR的高效电转化方法 .当质粒DNA为 1.5 μg/mL、转化时电压为175 0V时 ,可得到 2 6 1个转化子 ,经鉴定均为阳性克隆子 .此为以芽孢杆菌为宿主进行高效电转化及为建立适合工业应用的分泌型表达载体提供参考 . 展开更多

关键词 地衣芽孢杆菌 感受态细胞 诱导形成 高效电转化方法 分泌型表达载体

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