几丁质结合蛋白基因克隆、表达与纯化 被引量：6

1

作者 李美玉 曹洪玉 +1 位作者 张庆芳 王晓辉 《中国酿造》 CAS 北大核心 2015年第11期41-46,共6页

该研究通过聚合酶链反应(PCR)方法从假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)DL-6菌株中成功克隆了几丁质结合蛋白基因。PCR测序结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,其理论分子质量为58.517 ku,等电点(p I)4.35,命名为CBP58(Ge... 该研究通过聚合酶链反应(PCR)方法从假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)DL-6菌株中成功克隆了几丁质结合蛋白基因。PCR测序结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,其理论分子质量为58.517 ku,等电点(p I)4.35,命名为CBP58(GenBank登录号KF234016)。结构域分析结果表明,该蛋白包括1个33家族碳水化合物结合模块(CBM),2个类型3几丁质结合域(Cht BDs);用Insight II 2005软件以同源建模的方法构建CBP58蛋白CBM33结构域的三维结构模型,Ramachandram图谱检测和三维结构评估显示模型结构合理,整体相容性较为可信;将CBP58基因构建到p ET23b载体,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达;利用镍柱亲和层析纯化获得重组蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测显示目的蛋白可溶表达,为后期几丁质结合蛋白(CBP)的生化性质表征奠定理论基础。 展开更多

关键词 几丁质结合蛋白 假交替单胞菌DL-6 克隆 表达 纯化

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离子对萝卜中具有溶菌酶活性的几丁质结合蛋白活性的影响 被引量：4

2

作者 赖晓芳 沈善瑞 +1 位作者 王炜军 徐凤彩 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2012年第12期171-172,共2页

萝卜中有具有溶菌酶活性的几丁质结合蛋白(Chitin-binding proteins,CBPs),为了了解CBPs作用机制以及在萝卜中的生理功能,研究了各种离子对CBPs溶菌酶活性的影响。结果显示,一价阳离子对CBPs溶菌酶活性的影响随阴离子不同有差异,当阴离... 萝卜中有具有溶菌酶活性的几丁质结合蛋白(Chitin-binding proteins,CBPs),为了了解CBPs作用机制以及在萝卜中的生理功能,研究了各种离子对CBPs溶菌酶活性的影响。结果显示,一价阳离子对CBPs溶菌酶活性的影响随阴离子不同有差异,当阴离子为Cl-时,阳离子Na+、K+和NH4+对CBPs溶菌酶活性均有抑制作用,当阴离子为NO3-时,K+和NH4+低浓度时具有激活CBPs溶菌酶活性作用,K+和NH4+高浓度时具有抑制CBPs溶菌酶活性作用;二价阳离子对CBPs溶菌酶活性均具有抑制作用,Mn2+和Ca2+低浓度时具有激活CBP2溶菌酶活力作用。 展开更多

关键词 萝卜 溶菌酶活性 离子 稳定性 几丁质结合蛋白(CBPs)

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日本沼虾表皮几丁质结合蛋白基因的克隆以及KK-42对其表达的影响 被引量：2

3

作者 张宇 王佩 +1 位作者 吕艳杰 宁黔冀 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2016年第5期106-111,共6页

为探讨KK-42缩短日本沼虾蜕皮周期的可能机制,首次从日本沼虾步足表皮组织克隆了编码几丁质结合蛋白的一个新基因——MnCBP-1部分cDNA序列,对其序列进行生物信息学分析,qRT-PCR技术检测MnCBP-1基因的表达水平以及KK-42的影响.结果表明,M... 为探讨KK-42缩短日本沼虾蜕皮周期的可能机制,首次从日本沼虾步足表皮组织克隆了编码几丁质结合蛋白的一个新基因——MnCBP-1部分cDNA序列,对其序列进行生物信息学分析,qRT-PCR技术检测MnCBP-1基因的表达水平以及KK-42的影响.结果表明,MnCBP-1基因部分cDNA序列为1396bp,含有特征性的几丁质结合结构域(chitin-bind-4),经BLAST比对,MnCBP-1与蚤状溞相似性为44%.qRT-PCR结果显示,步足表皮组织内MnCBP-1基因表达量随着蜕皮前期(D0-2)的开始逐渐增多.KK-42处理后,蜕皮间期(C)幼虾内MnCBP-1基因表达水平分别在6、12、24和48h比对照组显著升高,而在D0-2期和D3-4期MnCBP-1基因转录物仅在个别时间点有所增多.研究表明,MnCBP-1基因表达与蜕皮周期有关,KK-42处理可显著诱导MnCBP-1基因表达,且表达的高峰提前至C期,这可能是KK-42缩短蜕皮周期的机制之一. 展开更多

关键词 日本沼虾 几丁质结合蛋白 KK-42 克隆 基因表达

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甲壳动物表皮几丁质结合蛋白结构与功能研究进展 被引量：4

4

作者 郑征帆 吕艳杰 宁黔冀 《水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期538-542,共5页

由于坚硬表皮的限制,甲壳动物必须经过蜕皮才能生长。蜕皮是一个周期性的动态过程,包括旧表皮降解和新表皮的形成。作为表皮组成成分的几丁质是和蛋白质以结合的形式存在,此蛋白即为几丁质结合蛋白（CBPs）,是甲壳动物表皮中重要的结构... 由于坚硬表皮的限制,甲壳动物必须经过蜕皮才能生长。蜕皮是一个周期性的动态过程,包括旧表皮降解和新表皮的形成。作为表皮组成成分的几丁质是和蛋白质以结合的形式存在,此蛋白即为几丁质结合蛋白（CBPs）,是甲壳动物表皮中重要的结构性蛋白,该类蛋白一般含有特征性的结构域,由蜕皮激素的靶组织——表皮上皮细胞按照一定的周期和步骤表达合成。 展开更多

关键词 甲壳动物 几丁质结合蛋白 结构 功能

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棉铃虫围食膜肠粘蛋白HaIIM72真核表达及几丁质结合活性检测

5

作者 张晓刚 郭巍 +3 位作者 徐大庆 赵丹 孙伟明 单鸣 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期92-96,共5页

在前期工作中,本实验室已成功克隆得到棉铃虫粘蛋白基因haiim72。为了研究粘蛋白HaIIM72的生化特性,本试验将haiim72基因克隆到质粒pFastBacTM,转化大肠杆菌DH10Bac,构建重组杆状病毒bacmid-hai-im72,转染昆虫细胞系BTI-TN-5B1-4(HighFi... 在前期工作中,本实验室已成功克隆得到棉铃虫粘蛋白基因haiim72。为了研究粘蛋白HaIIM72的生化特性,本试验将haiim72基因克隆到质粒pFastBacTM,转化大肠杆菌DH10Bac,构建重组杆状病毒bacmid-hai-im72,转染昆虫细胞系BTI-TN-5B1-4(HighFive)从而在昆虫细胞系中进行表达。结果表明:成功表达了分子量约260kDa的棉铃虫围食膜肠粘蛋白HaIIM72。几丁质结合活性试验表明,肠粘蛋白HaIIM72具有几丁质结合活性,能够被较强的变性剂洗脱,属于第三类围食膜蛋白。 展开更多

关键词 棉铃虫 围食膜 肠粘蛋白HaIIM72 真核表达 几丁质结合活性

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甜菜夜蛾SeCDA8的基因克隆、蛋白表达及几丁质结合活性分析

6

作者 吴涵 赵丹 +3 位作者 郭晓昌 刘兆瑞 郭巍 毕扬 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2022年第6期1508-1515,共8页

几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)能催化几丁质脱乙酰化产生壳聚糖,在几丁质降解过程中发挥着重要作用。本研究通过分析甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)转录组得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的全长CDS序列,命名为SeCDA8(GenBank登... 几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)能催化几丁质脱乙酰化产生壳聚糖,在几丁质降解过程中发挥着重要作用。本研究通过分析甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)转录组得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的全长CDS序列,命名为SeCDA8(GenBank登录号为OL689577),其开放阅读框为1158 bp,编码385个氨基酸。NCBI Blast和系统进化分析表明其属于肠道特异CDA蛋白,与斜纹夜蛾CDA相似度最高。成功构建原核重组表达载体pET30a-SeCDA8,转化大肠杆菌,经超声破碎后在沉淀中表达45 kD的重组蛋白。重组Se CDA8蛋白的几丁质结合活性分析结果显示,Se CDA8蛋白与再生几丁质的结合活性较高于胶体几丁质,但均较弱。q RT-PCR分析显示,Se CDA8在前肠和中肠前部高表达,推测其可能与围食膜形成有关。通过探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶Se CDA8蛋白的几丁质结合活性和组织定位,为更加深入地探究第Ⅴ类CDA的生理功能提供了重要的理论依据。 展开更多

关键词 甜菜夜蛾 几丁质脱乙酰酶 表达 几丁质结合活性 组织定位

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家蝇几丁质结合蛋白(Md-CBPⅠ)的表达纯化及活性分析

7

作者 袁野 闫恕 +4 位作者 张丹丹 孔令聪 裴志花 刘树明 马红霞 《中国兽药杂志》 北大核心 2016年第1期8-13,共6页

为了研究家蝇几丁质结合蛋白(Md-CBPⅠ)在家蝇防御体系中的相关活性,采用PCR技术,对从鸡源沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选到的家蝇幼虫几丁质结合蛋白Ⅰ基因(Musca domestica chitin binding proteinⅠ,Md-CBPⅠ... 为了研究家蝇几丁质结合蛋白(Md-CBPⅠ)在家蝇防御体系中的相关活性,采用PCR技术,对从鸡源沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选到的家蝇幼虫几丁质结合蛋白Ⅰ基因(Musca domestica chitin binding proteinⅠ,Md-CBPⅠ)进行扩增,并成功构建了重组表达质粒p ET-32a-Md-CBPⅠ,于大肠杆菌BL21(DE3)中得以高效表达,纯化并获得了MdCBPⅠ融合蛋白。进一步对该蛋白的亲和活性进行了研究,发现Md-CBPⅠ融合蛋白对几丁质以及纤维素均有一定的结合作用,且其对几丁质的结合作用相对较好。试验为家蝇几丁质结合蛋白生物学活性和免疫学活性的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 家蝇 几丁质结合蛋白 克隆 原核表达

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热液区管状蠕虫几丁质结合蛋白的克隆表达及功能鉴定

8

作者 闫鑫富 阮灵伟 《台湾海峡》 CAS CSCD 2012年第1期34-38,共5页

本文应用PCR技术对四种管状蠕虫几丁质结合蛋白进行了扩增,进而连接到pIZ-FLAG构建了重组表达载体,并在昆虫细胞中实现了几丁质结合蛋白的异源重组表达.我们对几丁质结合蛋白的功能进行了初步研究,亲和活性实验结果表明这四种几丁质结... 本文应用PCR技术对四种管状蠕虫几丁质结合蛋白进行了扩增,进而连接到pIZ-FLAG构建了重组表达载体,并在昆虫细胞中实现了几丁质结合蛋白的异源重组表达.我们对几丁质结合蛋白的功能进行了初步研究,亲和活性实验结果表明这四种几丁质结合蛋白对α-chitin具有亲和活性,并且可以辅助几丁质酶,对降解α-chitin和β-chitin均有不同程度的促进作用,且作用效果明显.结果表明,这四种几丁质结合蛋白均为α型,且可以促进几丁质酶的活性,对降解几丁质多糖具有巨大的应用潜力和应用价值. 展开更多

关键词 海洋生物学 热液口 管状蠕虫 几丁质结合蛋白 克隆 表达

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甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

9

作者 张伟 毕扬 +2 位作者 赵丹 宗召莉 郭巍 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期111-117,共7页

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(GenBank登录号为MG604929),该基因长1431bp,包含开放阅读框长1134bp,Se... 几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(GenBank登录号为MG604929),该基因长1431bp,包含开放阅读框长1134bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156kD。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。 展开更多

关键词 甜菜夜蛾 几丁质脱乙酰酶SeCDA7 外源表达 组织定位分析 几丁质结合活性

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家蚕核型多角体病毒(陕西株)orf126基因的表达及与几丁质的体外结合实验

10

作者 郝碧芳 陈宏 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期350-353,共4页

为研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf126基因(Bm126)在感染宿主中的作用机制,采用PCR方法从BmNPV陕西株中克隆了切除N端23个氨基酸(预测信号肽序列)的Bm126基因,并将其和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合后在大肠杆菌中进行了表达。利用纯化... 为研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf126基因(Bm126)在感染宿主中的作用机制,采用PCR方法从BmNPV陕西株中克隆了切除N端23个氨基酸(预测信号肽序列)的Bm126基因,并将其和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合后在大肠杆菌中进行了表达。利用纯化的BM126重组蛋白与几丁质进行体外结合实验,Western blot分析没有检测到BM126重组蛋白与几丁质结合的复合物,推测原核表达的重组BM126融合蛋白在体外不能与几丁质结合。 展开更多

关键词 家蚕核型多角体病毒 orf126基因 C6基序 几丁质结合

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亚洲玉米螟CPT1蛋白的表达、纯化和与几丁质的结合能力 被引量：1

11

作者 蒋望 包涵 +2 位作者 陈金利 刘田 杨青 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期462-470,共9页

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是为害我国主要农作物玉米的一种重要害虫。昆虫表皮在运动、抵御机械损伤及对抗外界环境压力等方面发挥关键性作用。Tweedle(CPT)家族表皮蛋白在形成昆虫表皮中发挥重要作用,研究CPT有助于开发新一代害... 亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是为害我国主要农作物玉米的一种重要害虫。昆虫表皮在运动、抵御机械损伤及对抗外界环境压力等方面发挥关键性作用。Tweedle(CPT)家族表皮蛋白在形成昆虫表皮中发挥重要作用,研究CPT有助于开发新一代害虫防治方法。本研究在大肠杆菌系统中以包涵体的形式重组表达了Of CPT1蛋白,使用金属螯合层析进行纯化,复性得到了Of CPT1蛋白,收率为50 mg/L。几丁质结合试验发现,Of CPT1对α-几丁质、β-几丁质、壳聚糖、胶体几丁质和几丁质纳米微晶均有一定的结合能力,其中与几丁质纳米微丝结合能力最强。圆二色光谱结果表明,Of CPT1蛋白与壳聚糖结合后二级结构从以α-螺旋占主导变为以β-折叠占主导。本研究利用原核表达系统获得了亚洲玉米螟重组CPT蛋白并表征了它的部分生物化学性质。 展开更多

关键词 表皮蛋白 Tweedle 几丁质结合 杀虫剂靶标

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犬弓首蛔虫TcCPG1的表达及其与几丁质的结合特性

12

作者 陈绍基 李芳 +2 位作者 尹莎莎 江艾耘 周荣琼 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期356-364,共9页

为探讨犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)软骨素蛋白多糖TcCPG1的表达特征及其与几丁质的结合方式,为犬弓首蛔虫软骨素蛋白多糖的功能研究提供依据,笔者克隆T.canis软骨素蛋白多糖1基因(Tc-cpg-1)并原核表达重组蛋白TcCPG1,采用镍柱... 为探讨犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)软骨素蛋白多糖TcCPG1的表达特征及其与几丁质的结合方式,为犬弓首蛔虫软骨素蛋白多糖的功能研究提供依据,笔者克隆T.canis软骨素蛋白多糖1基因(Tc-cpg-1)并原核表达重组蛋白TcCPG1,采用镍柱亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,并与几丁质进行结合试验;采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)进行Tc-cpg-1基因的转录水平的性别和组织差异表达分析。结果显示:Tc-cpg-1基因编码区(coding sequence, CDS)的长度为1 251 bp,共编码417个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白TcCPG1以包涵体形式存在,相对分子质量大小约为70 ku;对表达条件进行优化后,以0.8 mmol·L-1 IPTG于16℃诱导14 h时可获得大量目的蛋白;利用镍柱亲和层析纯化可以获得具有较高纯度的目的蛋白,与几丁质进行结合试验,验证了重组蛋白TcCPG1能够与几丁质结合;通过qRT-PCR对Tc-cpg-1基因转录水平的组织差异性进行分析,发现Tc-cpg-1在雌虫中高量表达,尤其在雌虫的生殖组织中表达量最高,表明Tc-cpg-1可能参与了T.canis雌虫的生殖过程,推测TcCPG1可能通过与卵壳中几丁质的相互作用从而影响T.canis的胚胎和生殖发育过程。 展开更多

关键词 犬弓首蛔虫 CPG1 原核表达 几丁质结合

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暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因的细胞表达及活性分析 被引量：3

13

作者 赵丹 闫晓平 +1 位作者 陆秀君 郭巍 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期686-692,共7页

cdsRDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5基因,序列分析表明HpdsRCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于GroupdsRV类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pdsRFastdsRBac-HpdsRCDA5,转染昆虫细胞sf9,WesterndsRb... cdsRDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5基因,序列分析表明HpdsRCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于GroupdsRV类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pdsRFastdsRBac-HpdsRCDA5,转染昆虫细胞sf9,WesterndsRblot分析表明HpdsRCDA5在昆虫细胞sf9中成功表达42dsRkdsRDa的蛋白。利用qdsRRT-PCR方法分析HpdsRCDA5基因组织表达,结果显示HpdsRCDA5基因在中肠中表达最高,为中肠特异表达蛋白。几丁质结合活性表明HpdsRCDA5蛋白只能被强洗脱剂洗脱,具有很强的几丁质结合活性。本研究通过对暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpdsRCDA5的生化特性研究,为进一步明确HpdsRCDA5的生理功能提供理论依据,并为以HpdsRCDA5蛋白为靶标的暗黑鳃金龟生物防治提供支撑。 展开更多

关键词 暗黑鳃金龟 HpCDA5 细胞表达 组织表达分析 几丁质结合活性

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亚洲玉米螟表皮蛋白CPR9的表达纯化及与几丁质的相互作用 被引量：1

14

作者 卜云飞 刘田 +1 位作者 陈磊 杨青 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2020年第1期79-86,共8页

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米最重要的害虫,了解亚洲玉米螟表皮形成的机制将有助于对其开展生物防治。表皮蛋白和几丁质是构成昆虫表皮的两种主要成分,因此研究两者的相互作用对于阐明昆虫表皮形成机制具有关键意义。CPR9... 亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米最重要的害虫,了解亚洲玉米螟表皮形成的机制将有助于对其开展生物防治。表皮蛋白和几丁质是构成昆虫表皮的两种主要成分,因此研究两者的相互作用对于阐明昆虫表皮形成机制具有关键意义。CPR9是亚洲玉米螟体壁表皮转录组中相对丰度最高的表皮蛋白基因。序列分析发现CPR9属于CPR家族中RR-1亚家族的表皮蛋白,含有R&R结构域,可能是通过结合几丁质来发挥功能。为了研究CPR9与几丁质的相互作用,本研究利用p ET-SUMO载体实现了SUMO-CPR9融合蛋白的可溶表达,并通过SUMO蛋白酶处理及两次金属螯合亲和层析纯化了CPR9,平均收率为5 mg/L。几丁质结合试验发现,CPR9对不同类型的几丁质的结合具有选择性。CPR9对α-几丁质结合能力很强,对胶体几丁质结合能力较强,但不与β-几丁质结合。脱乙酰几丁质(壳聚糖)结合试验发现,CPR9能与脱乙酰几丁质结合并使其发生团聚。圆二色光谱分析表明,CPR9在结合脱乙酰几丁质后,其二级结构中平行β折叠和β转角比例上升,反平行β折叠及无规卷曲比例下降。本研究发现了CPR家族表皮蛋白与不同类型几丁质的结合存在特异性,而且在结合过程中会发生结构变化,有助于进一步了解昆虫表皮的形成机制。 展开更多

关键词 昆虫表皮 表皮蛋白 几丁质结合 结构变化

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一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定 被引量：12

15

作者 孙敬敬 刘慧慧 +4 位作者 周世权 王信超 范美华 申望 廖智 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期563-570,共8页

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261... 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分;经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域(Chitin-biding domain),因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量PCR检测表明,mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。 展开更多

关键词 厚壳贻贝 抗菌肽 几丁质结合结构域 荧光定量PCR

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双叉犀金龟表皮蛋白Td14144表达纯化及性质研究 被引量：1

16

作者 刘晶 包涵 +3 位作者 陈磊 刘源涛 刘田 杨青 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2022年第2期513-520,共8页

表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成份,在昆虫的生长发育过程中起着重要作用,有可能成为农业害虫的防治靶标。双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus是铁皮石斛的一种重要害虫,且对其表皮蛋白的研究较少。本文通过研究双叉犀金龟表皮蛋白Td1414... 表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成份,在昆虫的生长发育过程中起着重要作用,有可能成为农业害虫的防治靶标。双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus是铁皮石斛的一种重要害虫,且对其表皮蛋白的研究较少。本文通过研究双叉犀金龟表皮蛋白Td14144的表达纯化及与几丁质结合的相关性质明确Td14144功能的重要性。根据双叉犀金龟转录组测序数据,利用RT-PCR获得表皮蛋白Td14144基因(GenBank登录号:MZ463195),并对其进行生物信息学分析。序列分析表明表皮蛋白Td14144属于CPR家族中RR-2亚族,含有R&R保守结构域;系统进化分析结果表明,Td14144与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AgCP的亲缘关系最近。随后将基因片段与pET-28a载体同源重组构建表达载体pET28a-14144,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中原核表达,并使用金属螯合层析进行分离纯化,SDS-PAGE及Western blot验证重组蛋白的表达纯化,成功获得95%以上纯度的Td14144蛋白。利用几丁质结合试验评估Td14144与不同类型几丁质结合的能力,发现Td14144可以与壳聚糖、α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质结合,其中对壳聚糖和α-几丁质的结合能力最强。 展开更多

关键词 双叉犀金龟 表皮蛋白 几丁质结合蛋白

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萝卜CBPs溶菌酶活性的稳定性研究 被引量：1

17

作者 赖晓芳 沈善瑞 +1 位作者 王炜军 徐凤彩 《湖北农业科学》 北大核心 2013年第6期1330-1333,共4页

植物溶菌酶是植物防御体系中的一部分,在植物防卫体系中具有重要作用。萝卜中有2个具溶菌酶活性的几丁质结合蛋白(Chitin-binding proteins,CBPs),分别是CBP1、CBP2组分。为了解CBPs的作用机制以及在萝卜中的生理功能,试验研究了CBP1、C... 植物溶菌酶是植物防御体系中的一部分,在植物防卫体系中具有重要作用。萝卜中有2个具溶菌酶活性的几丁质结合蛋白(Chitin-binding proteins,CBPs),分别是CBP1、CBP2组分。为了解CBPs的作用机制以及在萝卜中的生理功能,试验研究了CBP1、CBP2溶菌酶组分酶活性的稳定性。结果显示,CBP1、CBP2在pH 5.4、65℃条件下迅速失活,在pH 3.4～10.6、25℃条件下较稳定;CBP1较CBP2对氧化剂H2O2、NaClO敏感;CBP2较CBP1对木瓜蛋白酶敏感;2个组分对胰蛋白酶均敏感。 展开更多

关键词 萝卜 溶菌酶活性 几丁质结合蛋白 稳定性

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双叉犀金龟表皮蛋白TdCPR12611与TdCPR7854的表达纯化及特性分析 被引量：3

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作者 叶长青 包涵 +1 位作者 刘田 杨青 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期19-29,共11页

【目的】探析双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus表皮蛋白的序列特征及生化性质。【方法】利用RT-PCR克隆双叉犀金龟表皮蛋白基因,利用生物信息学方法分析表皮蛋白的结构特征及系统发育;采用大肠杆菌Escherichia coli表达系统对双叉犀金... 【目的】探析双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus表皮蛋白的序列特征及生化性质。【方法】利用RT-PCR克隆双叉犀金龟表皮蛋白基因,利用生物信息学方法分析表皮蛋白的结构特征及系统发育;采用大肠杆菌Escherichia coli表达系统对双叉犀金龟表皮蛋白进行重组表达,并通过金属离子鳌合层析的方法对重组蛋白进行纯化;采用体外结合实验检测双叉犀金龟表皮蛋白与α-几丁质(α-chitin)、β-几丁质(β-chitin)、壳聚糖(chitosan)和胶体几丁质(colloidal chitin)的结合能力;观察确定蛋白液液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)性质。【结果】克隆获得双叉犀金龟表皮蛋白基因TdCPR 12611(GenBank登录号:MT813021)和TdCPR 7854(GenBank登录号:MT813022)。系统进化分析结果表明,TdCPR12611与食粪金龟Onthophagus taurus OtCP-1的亲缘关系最近;TdCPR7854与食粪金龟的OtCP-acp20-1,OtCP-acp20-2和OtCP-acp20-3的亲缘关系最为接近,它们均属于CPR_RR-2家族。原核表达和纯化获得重组表皮蛋白TdCPR12611和TdCPR7854。两重组表皮蛋白与4种类型的几丁质具有不同结合能力,其中有41.4%的TdCPR12611与壳聚糖结合,而有62.3%的TdCPR7854与β-几丁质结合。TdCPR12611具有内部较为无序的结构,并能够在室温条件下自发团聚形成液液相分离现象,而TdCPR7854不能。【结论】本研究测定分析了双叉犀金龟CPR_RR-2家族表皮蛋白TdCPR12611与TdCPR7854的序列特征和与几丁质的结合特性。研究结果有利于加深人们对于昆虫表皮装配机制的了解,为蛋白仿生材料开发提供思路。 展开更多

关键词 双叉犀金龟 表皮蛋白 CPR蛋白 RR-2家族 几丁质结合 液液相分离 仿生材料

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厚壳贻贝抗菌肽mytichitin-CB的固相化学合成、复性及功能 被引量：3

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作者 宫延斌 秦传利 +1 位作者 石戈 廖智 《浙江海洋大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2018年第1期8-13,75,共7页

抗菌肽是贻贝免疫系统的重要组成部分,也是开发新型生物抗生素的先导分子。厚壳贻贝抗菌肽mytichitin-CB是厚壳贻贝几丁质酶的C端天然裂解产物,具有几丁质结合结构域及抑菌活性。Mytichitin-CB分子在厚壳贻贝血清中含量极低,妨碍了后续... 抗菌肽是贻贝免疫系统的重要组成部分,也是开发新型生物抗生素的先导分子。厚壳贻贝抗菌肽mytichitin-CB是厚壳贻贝几丁质酶的C端天然裂解产物,具有几丁质结合结构域及抑菌活性。Mytichitin-CB分子在厚壳贻贝血清中含量极低,妨碍了后续研究。为深入研究mytichitin-CB的结构与功能,采用固相化学合成手段,成功合成了mytichitin-CB肽段,采用反相高效液相色谱和质谱对合成后的mytichitin-CB进行了纯度和精确分子量验证。通过氧化复性策略对合成后mytichitin-CB进行了成功复性,复性后的mytichitin-CB开展了抑菌活性测试,热稳定性和几丁质结合活性分析。结果表明合成mytichitin-CB对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌具有明显的抑制活性;经60℃温度处理后,其抑菌活性未见明显下降;合成mytichitin-CB与几丁质具有可逆结合作用。上述研究表明,合成mytichitin-CB具有与天然mytichitin-CB相似的结构与功能,可用于开展后续抗菌机制分析,同时,其较强的抑菌活性和较好的热稳定性为后续基于mytichitin-CB的生物抗生素研发奠定了基础。 展开更多

关键词 mytichitin-CB 固相化学合成 抑菌活性 几丁质结合结构域

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