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重组人凝血因子X在HEK293细胞中的表达及活性检测
1
作者
冯佳宁
邹森
+3 位作者
赵泽林
李肖肖
张志斐
杨兆勇
《安徽医科大学学报》
北大核心
2025年第9期1583-1590,共8页
目的瞬时转染重组人凝血因子X(rhFX)到HEK293细胞,优化转染条件,体外构建高效表达rhFX的方法,检测rhFX活性。方法pcDNA3.1-EGFP与F10基因构建真核表达载体pcDNA3.1-EGFP-FX并转染HEK293细胞,验证转染系统的有效性。pcDNA3.1与F10基因片...
目的瞬时转染重组人凝血因子X(rhFX)到HEK293细胞,优化转染条件,体外构建高效表达rhFX的方法,检测rhFX活性。方法pcDNA3.1-EGFP与F10基因构建真核表达载体pcDNA3.1-EGFP-FX并转染HEK293细胞,验证转染系统的有效性。pcDNA3.1与F10基因片段构建重组表达载体pcDNA3.1-FX,脂质体方法转染HEK293细胞,Western blot和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测细胞上清液中rhFX的表达。优化转染条件,ELISA测定rhFX的浓度;凝血酶原时间(PT)和发色底物法测定rhFX凝血生物活性。结果在HEK293细胞上清液中成功表达rhFX。在细胞密度80%,质粒DNA与聚乙烯亚胺(PEI)的比例为1∶2,转染后第3天,rhFX表达量最高。ELISA检测3次上清液表达量最高为5.20 ng/mL。与对照组pcDNA3.1空载体转染收集的上清液相比,实验组rhFX的PT时间更短(P<0.0001),基于rhFX的发色底物法测得依度沙班的半数抑制浓度(IC_(50))为1.449 nmol/L,与文献报导的0.78 nmol/L处于同一数量级。结论使用HEK293细胞成功表达出具有生物活性的rhFX蛋白,为进一步推动rhFX药物的研发奠定基础。
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关键词
重组人
凝
血
因子
x
瞬时表达
表达优化
HEK293细胞
凝血因子x缺乏症
凝
血
酶原时间
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职称材料
一个遗传性凝血因子XⅢ缺乏症家系FXⅢA链基因5’-端短串联重复序列[AAAG]n多态性分析
2
作者
肖德乾
王巍
+1 位作者
蔡望伟
周克元
《海南医学院学报》
CAS
2004年第4期223-225,共3页
目的:分析一个遗传性凝血因子XⅢ缺乏症家系FXⅢA基因5’-端非翻译区STR多态性,对该亚基的突变位点进行遗传分离分析。方法:应用PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法技术分析一个经测序确诊的凝血因子XⅢ基因缺乏的家系的凝血因子X...
目的:分析一个遗传性凝血因子XⅢ缺乏症家系FXⅢA基因5’-端非翻译区STR多态性,对该亚基的突变位点进行遗传分离分析。方法:应用PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法技术分析一个经测序确诊的凝血因子XⅢ基因缺乏的家系的凝血因子XⅢA亚基基因5’-端侧翼非翻译区短串联重复序列AAAGn。结果:在该家系中检测出两种基因型,先证者及其弟XⅢA亚基基因5’-端侧翼非翻译区短串联重复序列AAAGn的基因型为L2/L2基因型,先证者的父亲、母亲及其妹的基因型为L1/L2,先证者的XⅢA链基因的突变位点分别与父源的L2和母源的L2位点连锁。结论:根据家系XⅢA亚基基因5’-端侧翼非翻译区短串联重复序列AAAGn与FXⅢA基因突变位点的连锁关系可确定突变的遗传分离特点。
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关键词
遗传性
凝
血
因子
x
Ⅲ
缺乏症
家系
F
x
ⅢA链基因5’-端
短串联
重复序列
[AAAG]n
基因多态性
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职称材料
题名
重组人凝血因子X在HEK293细胞中的表达及活性检测
1
作者
冯佳宁
邹森
赵泽林
李肖肖
张志斐
杨兆勇
机构
华北理工大学药学院
中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所
出处
《安徽医科大学学报》
北大核心
2025年第9期1583-1590,共8页
基金
国家自然科学基金项目(编号:82373767、82301185)。
文摘
目的瞬时转染重组人凝血因子X(rhFX)到HEK293细胞,优化转染条件,体外构建高效表达rhFX的方法,检测rhFX活性。方法pcDNA3.1-EGFP与F10基因构建真核表达载体pcDNA3.1-EGFP-FX并转染HEK293细胞,验证转染系统的有效性。pcDNA3.1与F10基因片段构建重组表达载体pcDNA3.1-FX,脂质体方法转染HEK293细胞,Western blot和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测细胞上清液中rhFX的表达。优化转染条件,ELISA测定rhFX的浓度;凝血酶原时间(PT)和发色底物法测定rhFX凝血生物活性。结果在HEK293细胞上清液中成功表达rhFX。在细胞密度80%,质粒DNA与聚乙烯亚胺(PEI)的比例为1∶2,转染后第3天,rhFX表达量最高。ELISA检测3次上清液表达量最高为5.20 ng/mL。与对照组pcDNA3.1空载体转染收集的上清液相比,实验组rhFX的PT时间更短(P<0.0001),基于rhFX的发色底物法测得依度沙班的半数抑制浓度(IC_(50))为1.449 nmol/L,与文献报导的0.78 nmol/L处于同一数量级。结论使用HEK293细胞成功表达出具有生物活性的rhFX蛋白,为进一步推动rhFX药物的研发奠定基础。
关键词
重组人
凝
血
因子
x
瞬时表达
表达优化
HEK293细胞
凝血因子x缺乏症
凝
血
酶原时间
Keywords
recombinant human coagulation factor
x
instantaneous e
x
pression
e
x
pression optimization
HEK293 cells
coagulation factor
x
deficiency
prothrombin time
分类号
R554 [医药卫生—血液循环系统疾病]
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职称材料
题名
一个遗传性凝血因子XⅢ缺乏症家系FXⅢA链基因5’-端短串联重复序列[AAAG]n多态性分析
2
作者
肖德乾
王巍
蔡望伟
周克元
机构
海南医学院生物化学教研室
广东医学院生物化学与分子生物学教研室
出处
《海南医学院学报》
CAS
2004年第4期223-225,共3页
基金
国家自然科学基金(NO.30060037)
教育部科学技术研究重点项目(NO.03147)
文摘
目的:分析一个遗传性凝血因子XⅢ缺乏症家系FXⅢA基因5’-端非翻译区STR多态性,对该亚基的突变位点进行遗传分离分析。方法:应用PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染法技术分析一个经测序确诊的凝血因子XⅢ基因缺乏的家系的凝血因子XⅢA亚基基因5’-端侧翼非翻译区短串联重复序列AAAGn。结果:在该家系中检测出两种基因型,先证者及其弟XⅢA亚基基因5’-端侧翼非翻译区短串联重复序列AAAGn的基因型为L2/L2基因型,先证者的父亲、母亲及其妹的基因型为L1/L2,先证者的XⅢA链基因的突变位点分别与父源的L2和母源的L2位点连锁。结论:根据家系XⅢA亚基基因5’-端侧翼非翻译区短串联重复序列AAAGn与FXⅢA基因突变位点的连锁关系可确定突变的遗传分离特点。
关键词
遗传性
凝
血
因子
x
Ⅲ
缺乏症
家系
F
x
ⅢA链基因5’-端
短串联
重复序列
[AAAG]n
基因多态性
Keywords
Factor
x
Ⅲ Deficiency
Repeat sequence,Nucleic acid
PCR
Geneti cs,Biochemistry
分类号
R554 [医药卫生—血液循环系统疾病]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
重组人凝血因子X在HEK293细胞中的表达及活性检测
冯佳宁
邹森
赵泽林
李肖肖
张志斐
杨兆勇
《安徽医科大学学报》
北大核心
2025
0
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职称材料
2
一个遗传性凝血因子XⅢ缺乏症家系FXⅢA链基因5’-端短串联重复序列[AAAG]n多态性分析
肖德乾
王巍
蔡望伟
周克元
《海南医学院学报》
CAS
2004
0
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0
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