凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠近交系的建立 被引量：1

1

作者 郝光荣 孙伟 +4 位作者 胡卫江 陈立 崔淑芳 汤球 曹平 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期200-202,共3页

目的 :建立可稳定遗传、临床症状显著的凝血因子 (F )基因剔除小鼠近交系。 方法 :以 PCR扩增检测小鼠尾组织 DNA,一期法检定小鼠血浆 F 活性和血浆凝血酶原时间 (PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT)值 ;取以上结果为全阳性的小鼠以... 目的 :建立可稳定遗传、临床症状显著的凝血因子 (F )基因剔除小鼠近交系。 方法 :以 PCR扩增检测小鼠尾组织 DNA,一期法检定小鼠血浆 F 活性和血浆凝血酶原时间 (PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT)值 ;取以上结果为全阳性的小鼠以选优法进行全同胞兄妹交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,第 8代开始筛选纯合子。 结果 :F8代 F 基因剔除小鼠PCR检测阳性率 92 % ,到 F1 2 代小鼠阳性率达 10 0 % ;F 活性 (2 .4 7± 1.75 ) %较正常小鼠 (14 8.18± 4 6 .98) %明显降低 (P<0 .0 1) ;F 基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,遗传性状稳定 ,并有自发出血倾向。结论 :成功建立了纯合子 F 基因剔除小鼠近交系 ,该小鼠符合人血友病 展开更多

关键词 凝血因子ⅸ基因剔除小鼠 近交系 动物模型

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应用荧光原位杂交检测人凝血因子Ⅸ在转基因小鼠染色体上的整合 被引量：12

2

作者 肖艳萍 奚鹰 +1 位作者 黄文英 黄英 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期232-236,共5页

应用荧光原位杂交 (FISH)技术检测两个转基因小鼠家系从F1到F4 代的整合情况。阳性转基因小鼠 98%～ 10 0 %的中期分裂相 ,85 %～ 94%的间期核出现杂交信号 ;阴性对照小鼠 10 0 %的中期分裂相、95 %～ 96 %的间期核未出现杂交信号。结... 应用荧光原位杂交 (FISH)技术检测两个转基因小鼠家系从F1到F4 代的整合情况。阳性转基因小鼠 98%～ 10 0 %的中期分裂相 ,85 %～ 94%的间期核出现杂交信号 ;阴性对照小鼠 10 0 %的中期分裂相、95 %～ 96 %的间期核未出现杂交信号。结果表明 ,该FISH实验条件能对转基因整合位点进行高效特异检测。本文分析的两家系转基因小鼠均为单位点整合 ,但整合位点不同。各家系内F1到F4 代的转基因小鼠均可检出整合染色体 ,且整合位点相同 ,表明外源基因稳定整合并遗传给后代。 展开更多

关键词 荧光原位杂交 检测 人凝血因子ⅸ 转基因小鼠 染色体 整合位点

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小鼠胚胎干细胞凝血因子Ⅸ基因的定向敲除 被引量：5

3

作者 戴旭明 薛红 +3 位作者 杨桦 胡以平 傅继梁 陈竺 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第1期1-4,共4页

目的：将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ（ｍＦⅨ）基因定向敲除，为建立血友病Ｂ的转基因小鼠模型奠定基础；摸索建立ＥＳ细胞基因打靶技术体系。方法：将线性化的针对小鼠ｍＦⅨ基因组的基因打靶置换型载体（ｐＭＦⅨＤＥＬ）ＤＮＡ用电... 目的：将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ（ｍＦⅨ）基因定向敲除，为建立血友病Ｂ的转基因小鼠模型奠定基础；摸索建立ＥＳ细胞基因打靶技术体系。方法：将线性化的针对小鼠ｍＦⅨ基因组的基因打靶置换型载体（ｐＭＦⅨＤＥＬ）ＤＮＡ用电穿孔法转入小鼠ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，用ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交两种方法，鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况。结果：（１）从药物抗性细胞克隆中鉴定获得了４个发生了按所设计的方式进行了同源重组的ＥＳ细胞克隆；（２）观察到在ＥＳ细胞中，ｐＭＦⅨＤＥＬ载体ＤＮＡ与内源ｍＦⅨ基因发生同源重组的频率平均为１．６７×１０－６。结论：得到了４个ｍＦⅨ基因已被敲除的ＥＳ细胞克隆；建立了ＥＳ细胞基因打靶的技术体系。 展开更多

关键词 胚胎干细胞 基因敲除 凝血因子ⅸ 血友病B

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凝血因子IX基因剔除小鼠的遗传及血液学指标检测

4

作者 郝光荣 孙伟 +4 位作者 陈立 崔淑芳 汤球 黄立志 曹平 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2002年第4期233-235,共3页

目的　鉴定凝血因子IX基因剔除小鼠。方法　采用PCR扩增检测小鼠的DNA样品以及采用一期法检定小鼠血浆FIX活性和血浆凝血酶原时间 (plasmaprothrombintime ,PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (Kaolinpartialthromboplastintime ,KPTT)值。... 目的　鉴定凝血因子IX基因剔除小鼠。方法　采用PCR扩增检测小鼠的DNA样品以及采用一期法检定小鼠血浆FIX活性和血浆凝血酶原时间 (plasmaprothrombintime ,PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (Kaolinpartialthromboplastintime ,KPTT)值。结果　小鼠PCR检测为阳性 ,FIX活性 <5 %。结论　凝血因子IX基因剔除小鼠能稳定遗传 ,鉴定结果提示该小鼠符合人血友病B相应临床症状。 展开更多

关键词 白友病B 疾病模型 凝血因子ⅸ 基因剔除小鼠 遗传 血液学指标 检测

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人凝血因子Ⅸ基因直接注射入小鼠骨骼肌内表达的进一步研究

5

作者 郭华阳 刘昕 +7 位作者 王传松 王燕 纪贤文 许平庆 吕银慧 王仁鹏 谭骏 汪江华 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第5期415-417,共3页

目的：观察人凝血因子ⅨｃＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌后的存在和表达部位。方法：采用免疫组化和核酸杂交技术检测人Ⅸ因子ｃＤＮＡ注入小鼠肌肉后的存在和表达情况。结果：免疫组化和斑点杂交显示肌注４周时有Ⅸ因子的蛋白质和ｍＲＮＡ... 目的：观察人凝血因子ⅨｃＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌后的存在和表达部位。方法：采用免疫组化和核酸杂交技术检测人Ⅸ因子ｃＤＮＡ注入小鼠肌肉后的存在和表达情况。结果：免疫组化和斑点杂交显示肌注４周时有Ⅸ因子的蛋白质和ｍＲＮＡ表达。原位杂交显示肌注４周时局部肌细胞内仍有Ⅸ因子ｃＤＮＡ存在。 展开更多

关键词 基因治疗 人凝血因子ⅸ 骨骼肌 直接注射

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人凝血因子Ⅸ基因（pKG_5－Ⅸ）直接注入小鼠骨骼肌中瞬间表达的研究

6

作者 谭骏 王燕 +4 位作者 纪贤文 刘昕 朱锡华 薛京伦 邱信芳 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1994年第2期96-98,共3页

我们将带凝血Ⅸ因子基因ｃＤＮＡ的ｐＫＧ_５－Ⅸ裸ＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌内，注射后第１４天取小鼠血分离血清进行研究。结果显示：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析中能清晰地看到一与凝血因子ⅨｃＤＮ... 我们将带凝血Ⅸ因子基因ｃＤＮＡ的ｐＫＧ_５－Ⅸ裸ＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌内，注射后第１４天取小鼠血分离血清进行研究。结果显示：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析中能清晰地看到一与凝血因子ⅨｃＤＮＡ表达相关的特定蛋白带，进一步的实验ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ及一期法有力地证实了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，人ＦⅨ基因转移小鼠出现５５ｋＤ特异带与人ＦⅨ相符，即证明它确系人ＦⅨ。 展开更多

关键词 凝血因子ⅸ 基因表达 血友病B

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凝血因子IX基因剔除小鼠的培育历史与建系方法

7

作者 郝光荣 孙伟 +2 位作者 汤球 崔淑芳 黄立志 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2003年第2期120-121,共2页

目的　培育凝血因子IX基因剔除小鼠近交系。方法　采用全同胞兄妹对交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,记录繁殖性能 ;第 8代开始筛选纯合子。结果　凝血因子IX基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,交配年龄 70 - 90d ,平均每窝产仔数 5只以... 目的　培育凝血因子IX基因剔除小鼠近交系。方法　采用全同胞兄妹对交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,记录繁殖性能 ;第 8代开始筛选纯合子。结果　凝血因子IX基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,交配年龄 70 - 90d ,平均每窝产仔数 5只以上 ,离乳数 3只以上。 展开更多

关键词 凝血因子ⅸ基因 小鼠 培育 血友病B 动物模型

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逆转录病毒载体转染的人凝血因子Ⅸ基因在人脐带组织源间充质干细胞中的表达 被引量：3

8

作者 陈晓梨 董春兰 +8 位作者 冯小明 陈振萍 周泽平 许显辉 赵钦军 邱志勇 任倩 张蕾 韩忠朝 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2009年第1期184-187,共4页

为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨcDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G41... 为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨcDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G418筛选10天后获得全部的转染阳性细胞,从蛋白质水平和其功能活性上检测hFⅨ的表达。结果显示:配养上清液中可检测到hFⅨ的表达,每24小时分泌量达2.68±0.36μg/106细胞。Western blot检测表明,转导hFⅨ的hUCT-MSCs能分泌预期分子大小的hFⅨ入上清。功能性凝集测定实验表明了转导FⅨ的hUCT-MSCs2天培养上清中hFⅨ的活性为100%-130%。结论:pLEGFP-N1-hFⅨ能有效地转导hUCT-MSCs,并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,这为hUCT-MSCs成为血友病B基因治疗的细胞载体研究奠定了基础。 展开更多

关键词 逆转录病毒 人凝血因子ⅸ 人脐带组织源间充质干细胞 基因治疗 血友病B

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人源载体pHrnF9介导的凝血因子Ⅸ基因在肠上皮sw480细胞中的表达 被引量：2

9

作者 杜建伟 陈方平 +2 位作者 夏昆 文路 宋永平 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2008年第4期878-882,共5页

本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFⅨ用于血友病B基因治疗的可能性。用含人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480,用RT-PCR检测mRNA的转录,荧光显微镜观察转染效率,ELISA和一期... 本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFⅨ用于血友病B基因治疗的可能性。用含人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480,用RT-PCR检测mRNA的转录,荧光显微镜观察转染效率,ELISA和一期法检测蛋白表达及凝血活性。结果表明:转染后的细胞中有hFⅨmRNA的转录;荧光显微镜观察到48小时转染效率最高;ELISA法测得转染后24小时细胞上清中的hFⅨ蛋白量为(11.34±0.23)ng/(106cells.24h),第48小时hFⅨ蛋白量最高,达(29.34±1.00)ng/(106cells.24h),转染后72小时降为(12.45±0.15)ng)/(106cells.24h)。一期法结果显示转染pHrnF9的sw480细胞分泌的FⅨ有凝血活性,48小时达峰值(6.07±0.17)%/106cells,第72小时降至(1.81±0.06)%/106cells。结论:肠上皮细胞sw480转染pHrnF9质粒后可表达有凝血活性的hFⅨ,肠上皮细胞有望成为血友病B基因治疗的靶细胞。 展开更多

关键词 肠上皮细胞sw480 人源载体pHrnF9 凝血因子ⅸ 基因治疗

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重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义 被引量：2

10

作者 王刚 姜博文 +5 位作者 杨林花 聂欣 贾辰亮 刘静 申泉 柴宝峰 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期422-425,共4页

本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature terminati... 本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。 展开更多

关键词 血友病B 凝血因子ⅸ小基因 无义突变 稳定细胞株

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原代小鼠骨骼肌细胞和C 2C 12细胞转人凝血因子IX基因后高效表达及分泌功能 被引量：4

11

作者 王健民 侯军 KurachiK 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第9期593-597,共5页

目的：研究骨骼肌细胞作为基因治疗靶细胞，其合成、加工和分泌外源性蛋白质的功能。方法：应用骨骼肌细胞特异性和非特异性表达载体（ｐｄ Ｌ Ｍｅ４ｂ ＡｈⅨｍ 和 ＬⅨ Ｓ Ｎ）转染联合免疫缺陷（ Ｓ Ｃ Ｉ Ｄ）小鼠原代成肌细胞（ ... 目的：研究骨骼肌细胞作为基因治疗靶细胞，其合成、加工和分泌外源性蛋白质的功能。方法：应用骨骼肌细胞特异性和非特异性表达载体（ｐｄ Ｌ Ｍｅ４ｂ ＡｈⅨｍ 和 ＬⅨ Ｓ Ｎ）转染联合免疫缺陷（ Ｓ Ｃ Ｉ Ｄ）小鼠原代成肌细胞（ Ｓ Ｃ Ｉ Ｄ Ｍ Ｂ）和 Ｃ２ Ｃ１２ 成肌细胞系，观察这两种细胞在合成、加工和分泌人凝血因子Ⅸ（ ＦⅨ）蛋白质方面的异同。结果：在 Ｓ Ｃ Ｉ Ｄ Ｍ Ｂ中，ｐｄ Ｌ Ｍｅ４ｂ ＡｈⅨｍ可表达的 ＦⅨ 达２ ０００ ｎｇ·１０－ ６ ·（２４ ｈ）－ １ ，凝血活性达 ９５％ ～１０３％ 。比较细胞内和培养上清液中的 ＦⅨ蛋白及细胞内 ＦⅨｍ Ｒ Ｎ Ａ 丰度变化表明， Ｃ２ Ｃ１２ 细胞分泌 ＦⅨ的功能不如 Ｓ Ｃ Ｉ Ｄ Ｍ Ｂ，而合成、加工 ＦⅨ的能力与 Ｓ Ｃ Ｉ Ｄ Ｍ Ｂ相似。结论：原代小鼠骨骼肌细胞可高效表达、加工和分泌外源性基因产物；在以骨骼肌细胞作为靶细胞进行基因治疗研究时，应尽量应用原代细胞。本研究为临床应用骨骼肌细胞作为基因治疗靶细胞奠定了实验基础。 展开更多

关键词 骨骼肌成肌细胞 凝血因子ⅸ 基因治疗 血友病B

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结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ基因载体治疗血友病B的安全性研究 被引量：1

12

作者 彭捷 王华 +2 位作者 陈方平 王光平 彭建强 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期487-489,共3页

目的分析结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ(rAAV2/CMV-hFⅨ)基因载体治疗血友病B小鼠的安全性。方法将rAAV2/CMV-hFⅨ(剂量为1×1013 v.g/kg)结肠灌注血友病B模型小鼠,分别检测抗重组腺相关病毒2(rAAV2)抗体和抗人凝血因子Ⅸ(h... 目的分析结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ(rAAV2/CMV-hFⅨ)基因载体治疗血友病B小鼠的安全性。方法将rAAV2/CMV-hFⅨ(剂量为1×1013 v.g/kg)结肠灌注血友病B模型小鼠,分别检测抗重组腺相关病毒2(rAAV2)抗体和抗人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)抗体,并通过组织病理学、免疫组化和PCR技术分析病毒和hFⅨ的组织分布。结果灌注后,在小鼠体内能够检测到抗rAAV2抗体和抗hFⅨ抗体;组织病理学、免疫组化和PCR技术分析结果显示灌注部位肠组织无明显病理改变,rAAV2以及hFⅨ基因仅仅在灌注的肠上皮。结论结肠灌注重组腺相关病毒基因治疗血友病B小鼠,在所观测时间内是安全的。 展开更多

关键词 重组腺相关病毒 血友病B 凝血因子ⅸ 基因治疗 结肠灌注 安全性

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凝血因子Ⅸ复合物制品在鼠非停滞模型上的潜在致血栓性的评价

13

作者 余蓉 邬杨斌 +1 位作者 杜俊蓉 李晓红 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期206-210,共5页

目的　评价两种凝血因子Ⅸ复合物的潜在致血栓危险性。方法　采用鼠非停滞模型 ,动态监测可溶性纤维蛋白单体复合物、纤维蛋白降解产物、D 二聚体、组织纤溶酶原激活剂等指标的变化。结果　采用国产DEAE 琼脂糖快胶离子交换层析和Ca3(PO... 目的　评价两种凝血因子Ⅸ复合物的潜在致血栓危险性。方法　采用鼠非停滞模型 ,动态监测可溶性纤维蛋白单体复合物、纤维蛋白降解产物、D 二聚体、组织纤溶酶原激活剂等指标的变化。结果　采用国产DEAE 琼脂糖快胶离子交换层析和Ca3(PO4 ) 2 吸附法相结合的层析工艺制备的凝血因子Ⅸ复合物引起的上述指标的变化均明显低于改良凝胶吸附法制备的凝血因子Ⅸ复合物。结论　用国产DEAE 琼脂糖快胶离子交换层析和Ca3(PO4 ) 2 吸附法相结合的层析工艺可明显减少凝血因子活化 。 展开更多

关键词 凝血因子ⅸ复合物 制品 非停滞模型 评价 大鼠 血栓栓塞

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中国汉族人群凝血因子Ⅸ基因限制性片段长度多态性的研究 被引量：4

14

作者 毕作木 华宝来 +3 位作者 杨仁池 王鸿艳 武文杰 钱林生 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2002年第3期247-250,共4页

为探讨中国人群中凝血因子Ⅸ ( FⅨ )基因SalⅠ ,NruⅠ和MseⅠ酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP) ,采用聚合酶链反应 (PCR)方法 ,以三代内相互间无亲缘关系的正常汉族人为研究对象 ,对其 FⅨ基因内含子 1第 192位以及 5′端 - 793... 为探讨中国人群中凝血因子Ⅸ ( FⅨ )基因SalⅠ ,NruⅠ和MseⅠ酶切位点的限制性片段长度多态性(RFLP) ,采用聚合酶链反应 (PCR)方法 ,以三代内相互间无亲缘关系的正常汉族人为研究对象 ,对其 FⅨ基因内含子 1第 192位以及 5′端 - 793位核苷酸A和G的频率和 5′端 - 6 98位核苷酸T和C的频率进行了分析 ,其中对FⅨ - 192共分析了 2 14条X染色体 ,对 FⅨ - 793共分析了 2 10条X染色体 ,对 FⅨ - 6 98共分析了 2 0 6条X染色体。结果表明 :FⅨ基因内含子 1第 192位A和G的频率分别为 0 .878和 0 .12 2 ,杂合体频率为 0 .2 13;- 793位核苷酸A和G的频率分别为 0 .5 5 2和 0 .4 4 8,杂合体频率为 0 .4 94 ;FⅨ - 6 98位核苷酸T和C的频率分别为 0 .311和 0 .6 89,杂合体频率为 0 .4 2 9。结论提示 :FⅨ基因SalⅠ。 展开更多

关键词 中国 汉族人 凝血因子ⅸ基因 限制性片段长度多态性 血友病B 聚合酶链反应

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慢病毒介导的B区缺失的人凝血因子Ⅷ在NOD/SCID小鼠中的持续表达(英文) 被引量：3

15

作者 李艳杰 陈翀 +2 位作者 曾令宇 曹江 徐开林 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期658-663,共6页

近年来,基因治疗作为一种新的治疗方法给血友病A的治疗提供了新的思路。本研究旨在探讨在体外和NOD/SCID小鼠中应用慢病毒载体介导的血友病A基因疗法的可能性。构建含有B区缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因和IRES-eGFP编码序列的慢病毒... 近年来,基因治疗作为一种新的治疗方法给血友病A的治疗提供了新的思路。本研究旨在探讨在体外和NOD/SCID小鼠中应用慢病毒载体介导的血友病A基因疗法的可能性。构建含有B区缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因和IRES-eGFP编码序列的慢病毒表达载体pXZ9/BDDFⅧ。通过3质粒共转染293FT包装细胞,包装后感染293FT,HLF,Chang-liver和人骨髓间充质干细胞。在感染后分别通过酶联免疫吸附试验(ELISA),一期法,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和聚合酶链反应(PCR)法检测凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性,FⅧ抗原,FⅧ的mRNA转录和基因整合情况。超速离心收集病毒颗粒,并通过门静脉注射感染NOD/SCID小鼠。ELISA分析小鼠血浆FⅧ抗原,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,转导后1个月RT-PCR分析小鼠肝脏人FⅧ的转录情况。结果表明:成功制备高浓度的重组慢病毒,并能在体外高效转导靶细胞。感染后72 h能检测到高水平的FⅧ活性和FⅧ抗原。RT-PCR和PCR法能敏感检测到人FⅧ基因转录和整合至感染后的细胞中。在所有接受重组慢病毒颗粒注射后的NOD/SCID小鼠肝脏中均能检测到人FⅧ基因的转录,同时重组慢病毒也能在体内高效转导小鼠肝细胞。在感染后72 h小鼠血浆中人FⅧ水平为(49±6)mU,1周后为(54±8)mU,1个月后为(23±4)mU。结论:携带BDDhFⅧ基因的慢病毒颗粒在体内外能高效转导靶细胞,且所有被转导的靶细胞都能有效的分泌人FⅧ。经过门静脉注射慢病毒颗粒的NOD/SCID小鼠可以持续表达人FⅧ。 展开更多

关键词 慢病毒载体 NOD/SCID小鼠 血友病A B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因 基因治疗

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腺病毒载体中凝血因子IX基因表达的电镜检测 被引量：1

16

作者 王琪 卢大儒 +3 位作者 邱信芳 薛京伦 颜永碧 郑尊 《电子显微学报》 CAS CSCD 1996年第5期422-422,共1页

腺病毒载体中凝血因子ＩＸ基因表达的电镜检测王琪卢大儒邱信芳薛京伦颜永碧郑尊（复旦大学遗传学研究所，上海２００４３３）（第二军医大学中心实验室）人凝血因子ＩＸ基因（ＨｕｍａｎＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＩＸ，ｈＦ... 腺病毒载体中凝血因子ＩＸ基因表达的电镜检测王琪卢大儒邱信芳薛京伦颜永碧郑尊（复旦大学遗传学研究所，上海２００４３３）（第二军医大学中心实验室）人凝血因子ＩＸ基因（ＨｕｍａｎＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＩＸ，ｈＦＩＸ）缺陷可导致遗传性出血性疾病，... 展开更多

关键词 血友病 凝血因子ⅸ基因 腺病毒载体 基因治疗

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利用动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ 被引量：2

17

作者 寇贺红 欧阳五庆 +1 位作者 张文娟 许小成 《动物科学与动物医学》 2004年第10期7-9,共3页

转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达,并从转基因动物奶中获 取重组蛋白。利用转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ是一种新型的生物制药方法且具有广阔的应用前景。本文... 转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达,并从转基因动物奶中获 取重组蛋白。利用转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ是一种新型的生物制药方法且具有广阔的应用前景。本文就转基因动物 乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ的载体构建、研究现状以及存在的问题等作一综述。 展开更多

关键词 乳腺生物反应器 凝血因子ⅸ 血友病B 转基因动物

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无义突变的人凝血因子IX小基因稳定细胞株选择性剪接的研究 被引量：1

18

作者 王刚 孙雯雯 +7 位作者 朱履锴 马艳春 张夏林 张建华 任娟 秦秀玉 杨林花 柴宝峰 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期228-232,共5页

目的:探讨无义突变的人凝血因子IX小基因稳定细胞株发生选择性剪接的分子机制。方法:将人凝血因子IX小基因(Mini-hF9)及其无义突变体分别转染哺乳动物细胞HeLa,经G418抗性筛选、单克隆化得到稳定细胞株;通过RT-PCR及Western blot分别检... 目的:探讨无义突变的人凝血因子IX小基因稳定细胞株发生选择性剪接的分子机制。方法:将人凝血因子IX小基因(Mini-hF9)及其无义突变体分别转染哺乳动物细胞HeLa,经G418抗性筛选、单克隆化得到稳定细胞株;通过RT-PCR及Western blot分别检测稳定细胞株中Mini-hF9基因mRNA的选择性剪接及蛋白表达情况。结果:成功构建了野生型和无义突变的人凝血因子IX小基因稳定细胞株HeLa-F9-WT、HeLa-F9-M1和HeLa-F9-M2。野生型稳定细胞株HeLa-F9-WT中扩增到正常剪接产物Norm;无义突变稳定细胞株HeLa-F9-M1中扩增到Norm和Alt-S1这两种剪接产物,HeLa-F9-M2中扩增到Norm、Alt-S1和Alt-S2这三种剪接产物。结论:无义突变的凝血因子IX基因可能触发无义相关的选择性剪接(NAS)途径,导致选择性剪接的产生。 展开更多

关键词 血友病 凝血因子ⅸ小基因 无义突变 稳定细胞株 无义相关的选择性剪接

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应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变 被引量：12

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作者 张媛 杨林花 +4 位作者 陆晔玲 丁秋兰 王学锋 刘秀娥 侯丽虹 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2009年第2期476-478,共3页

为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ∶C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列。结果表明:... 为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ∶C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列。结果表明:与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ∶C测定值明显降低,PT测定值正常。测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6G22119A点突变,患者2有外显子1G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变。结论:3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据。 展开更多

关键词 血友病B 凝血因子ⅸ 基因突变 DNA测序技术

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血友病B家系的基因测序与高危胎儿的产前诊断 被引量：1

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作者 吴庆华 史惠蓉 +3 位作者 鲁宁 江淼 赵振华 孔祥东 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2012年第5期639-642,共4页

目的:对3个血友病B家系进行凝血因子Ⅸ(F9)基因突变分析,并对家系中的4个高危胎儿行产前诊断。方法:采用PCR反应和扩增后DNA直接测序技术对3个家系先证者及其家系成员F9基因的8个外显子进行序列分析,确定先证者及携带者的基因型后取羊... 目的:对3个血友病B家系进行凝血因子Ⅸ(F9)基因突变分析,并对家系中的4个高危胎儿行产前诊断。方法:采用PCR反应和扩增后DNA直接测序技术对3个家系先证者及其家系成员F9基因的8个外显子进行序列分析,确定先证者及携带者的基因型后取羊水或绒毛进行产前诊断。结果:3个家系患者中均检出了F9基因突变,分别为G79R(c.10487G>A)、17788DelG、IVS2+4A>T(c.6493A>T)突变,其中,17788DelG为国内外首次报道的突变。女性携带者中检测出上述位点的杂合突变。家系1和家系2中行产前诊断的男性胎儿未携带F9基因突变,家系3中女性胎儿携带有IVS2+4A>T杂合突变,出生后随访均证实产前诊断的结果。结论:F9基因G79R、17788DelG、IVS2+4A>T是3个血友病B家系的致病性突变,应用基因测序技术可以对血友病B家系行有效的基因和产前诊断。 展开更多

关键词 血友病B 凝血因子ⅸ基因 突变 产前诊断

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