目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的成年雄性(SD)大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响,并进一步探讨r Hu EPO作用的可能...目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的成年雄性(SD)大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响,并进一步探讨r Hu EPO作用的可能机制。方法于2010年3月,由河北省实验动物中心提供的健康清洁级成年SD大鼠。采用PTZ点燃大鼠SE模型,将大鼠随机分为B组(PTZ+0.9%氯化钠溶液)、C组(PTZ+r Hu EPO)、D组(PTZ+LY294002+r Hu EPO)、E组(PTZ+二甲基亚砜+r Hu EPO),同时另选取不进行SE制模的SD大鼠作为A组(0.9%氯化钠溶液),检测大鼠行为学和脑电图的改变;用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测海马神经元的凋亡情况;免疫组织化学法观察p-Akt、Bax、XIAP的阳性细胞数;反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马Bax信使RNA(BaxmRNA)的表达;Western blot方法检测各组大鼠海马蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、XIAP蛋白的表达。结果与B组比较,C组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均增多,Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均减少,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均减少,Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 r Hu EPO可以提高p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达水平,降低Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平,减少海马神经元的凋亡,发挥神经保护作用;加入磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002后,海马p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达减少、Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达增加,海马神经元的凋亡增加,减弱了r Hu EPO的保护作用。因此,PI3K/Akt信号通路是r Hu EPO发挥神经保护作用的通路之一,其作用机制可能是r Hu EPO活化PI3K/Akt后,提高p-Akt蛋白及线粒体凋亡途径相关调控因子XIAP的表达,下调了Bax的表达,从而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。展开更多
目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性。方法:应用Stratagene BacterioMatch two hy-brid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合...目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性。方法:应用Stratagene BacterioMatch two hy-brid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合表达质粒。重组质粒分别相应共转化报告菌株XL1-Blue MRF,报道基因产物以抗羧苄青霉素和β-半乳糖苷酶活性作为转录激活的指标。结果:pTRG-TRAIL与pBT-DR4,pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后在高浓度羧苄青霉素(500μg/ml以上)筛选下宿主菌呈转录激活状态,pTRG-TRAIL与pBT-OPG组共转化后在低浓度羧苄青霉素(250μg/ml以下)筛选下宿主菌呈转录激活状态,用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆。对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2,pBT-DR4、pBT-DR5或pBT-OPG与pTRG-Gal114组共转化后呈阴性。结论:所用的双杂交序列皆为编码这些蛋白质的细胞外区域,而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证,所以细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究。展开更多
文摘目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的成年雄性(SD)大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响,并进一步探讨r Hu EPO作用的可能机制。方法于2010年3月,由河北省实验动物中心提供的健康清洁级成年SD大鼠。采用PTZ点燃大鼠SE模型,将大鼠随机分为B组(PTZ+0.9%氯化钠溶液)、C组(PTZ+r Hu EPO)、D组(PTZ+LY294002+r Hu EPO)、E组(PTZ+二甲基亚砜+r Hu EPO),同时另选取不进行SE制模的SD大鼠作为A组(0.9%氯化钠溶液),检测大鼠行为学和脑电图的改变;用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测海马神经元的凋亡情况;免疫组织化学法观察p-Akt、Bax、XIAP的阳性细胞数;反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马Bax信使RNA(BaxmRNA)的表达;Western blot方法检测各组大鼠海马蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、XIAP蛋白的表达。结果与B组比较,C组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均增多,Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均减少,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均减少,Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 r Hu EPO可以提高p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达水平,降低Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平,减少海马神经元的凋亡,发挥神经保护作用;加入磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002后,海马p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达减少、Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达增加,海马神经元的凋亡增加,减弱了r Hu EPO的保护作用。因此,PI3K/Akt信号通路是r Hu EPO发挥神经保护作用的通路之一,其作用机制可能是r Hu EPO活化PI3K/Akt后,提高p-Akt蛋白及线粒体凋亡途径相关调控因子XIAP的表达,下调了Bax的表达,从而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。
