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pIRES-p16ink4a-hRb1载体的构建及其对骨肉瘤细胞周期的调控 被引量：2
1
作者 廖翔 杨述华 +3 位作者 邵增务 李进 刘勇 熊晓芊 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期224-227,240,共5页
目的应用内部核糖体插入位点(IRES)序列构建单启动子双顺反子穿梭载体pIRES-p16ink4a-hRb1并鉴定,观察其导入骨肉瘤细胞后对细胞周期的调控。方法利用基因工程技术,将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中,质粒构建通过... 目的应用内部核糖体插入位点(IRES)序列构建单启动子双顺反子穿梭载体pIRES-p16ink4a-hRb1并鉴定,观察其导入骨肉瘤细胞后对细胞周期的调控。方法利用基因工程技术,将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中,质粒构建通过PCR、双酶切与测序鉴定;脂质体转染至p16ink4a表达缺失、hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63,G418筛选获得抗性克隆,通过RT-PCR和Western blot法分析外源基因表达;流式细胞术分析细胞周期特异性和细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果成功构建出pIRES-p16ink4a-hRb1载体,外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比较,双基因导入组细胞生长抑制率显著上升,细胞周期显著阻滞在G1期,且细胞凋亡率极显著升高。结论pIRES-p16ink4a-hRb1双顺反子穿梭载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功,为进一步研究p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 p16ink4a基因 hRb1基因 内部核糖体插入位点 细胞周期
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