灵武长枣果实阿拉伯半乳糖蛋白免疫荧光定位 被引量：3

1

作者 王静 章英才 陶珊珊 《电子显微学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期293-307,共15页

目的:为探讨灵武长枣果实AGPs糖蛋白在果实发育过程中的分布特征和动态变化规律。方法:以4个时期灵武长枣果实为实验材料,通过免疫组织化学方法,研究了不同发育时期果实阿拉伯半乳糖蛋白AGPs的分布,为进一步研究灵武长枣果实AGPs在品质... 目的:为探讨灵武长枣果实AGPs糖蛋白在果实发育过程中的分布特征和动态变化规律。方法:以4个时期灵武长枣果实为实验材料,通过免疫组织化学方法,研究了不同发育时期果实阿拉伯半乳糖蛋白AGPs的分布,为进一步研究灵武长枣果实AGPs在品质调控方面的功能奠定基础。结果:(1)JIM13和JIM8抗体所识别的抗原在4个时期果实的外果皮及相邻的内部数层排列紧密的中果皮小细胞细胞壁和细胞内部均有分布。(2)除了空腔之外,内部的中果皮大型卵圆形薄壁细胞的细胞壁和细胞内在膨大前期均有JIM13和JIM8抗体所识别的抗原分布,而快速膨大期、着色期和完熟期果实JIM13和JIM8抗体所识别的抗原均主要分布于细胞壁上,大部分细胞内部无分布;随着果实发育成熟,空腔数量增多,中果皮薄壁细胞间隙拉大排列更加松散,出现细胞破裂,JIM13和JIM8抗体所识别的抗原分布逐渐减少。(3)4个时期果实维管束中维管束鞘、木质部、韧皮部、形成层所有细胞的细胞壁和细胞内部都分布有JIM13和JIM8抗体所识别的抗原,维管束数量和大小随果实发育及体积的进一步增大逐渐减少,JIM13和JIM8抗体所识别的抗原分布逐渐减少。结论:JIM13和JIM8为灵武长枣果实免疫组织化学的良好抗体,各时期果实的不同组织JIM13和JIM8抗体所识别的抗原荧光强弱存在一定的差异;AGPs参与了灵武长枣果实维管束发育过程的形态建成、细胞的分裂和体积的增大,为果实发育提供营养支持及保护。 展开更多

关键词 灵武长枣 果实 阿拉伯半乳糖蛋白 免疫荧光定位

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核桃举肢蛾性信息素结合蛋白2的分子克隆和免疫荧光定位 被引量：8

2

作者 李文海 黄兴龙 +1 位作者 王敦 冯纪年 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期1054-1062,共9页

【目的】明确核桃举肢蛾Atrijuglans hetaohei Yang性信息素结合蛋白2(Ahet PBP2)在核桃举肢蛾触角中的分布。【方法】本研究提取羽化后3-4 d的核桃举肢蛾成虫触角总RNA并反转录合成c DNA,设计简并引物进行RTPCR获得c DNA片段,然后利用R... 【目的】明确核桃举肢蛾Atrijuglans hetaohei Yang性信息素结合蛋白2(Ahet PBP2)在核桃举肢蛾触角中的分布。【方法】本研究提取羽化后3-4 d的核桃举肢蛾成虫触角总RNA并反转录合成c DNA,设计简并引物进行RTPCR获得c DNA片段,然后利用RACE技术获得Ahet PBP2全长c DNA序列。将去除信号肽序列的Ahet PBP2进行原核表达,重组蛋白经镍柱纯化并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体作为一抗对核桃举肢蛾触角进行免疫组化分析。【结果】Ahet PBP2基因c DNA序列全长923 bp,开放阅读框504 bp,共编码167个氨基酸,分子量为19.26 k D,等电点为5.47。1 mmol/L IPTG诱导10 h获得可溶性重组蛋白,Western blot结果表明重组蛋白诱导表达成功,ELISA检测显示抗体效价为1∶1 024 000。免疫荧光定位结果显示核桃举肢蛾成虫触角部分感器被Ahet PBP2抗体标记。【结论】核桃举肢蛾成虫触角的部分感器中可能存在Ahet PBP2,推测该部分感器具有感受性信息素的功能。 展开更多

关键词 核桃举肢蛾 性信息素结合蛋白 原核表达 多克隆抗体 免疫荧光定位

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犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的原核表达及其免疫荧光定位

3

作者 张浩杰 刘梅 +6 位作者 李春燕 何冉 兰景超 罗娌 古小彬 谢跃 杨光友 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第9期1453-1460,共8页

对犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的基本特征进行探究,并评估其诊断价值,旨在为犬恶丝虫病的诊断提供依据。本研究原核表达了Di-NDPK,通过生物信息学、免疫印迹和免疫荧光组化分析了该蛋白的基本特征,通过检测犬恶丝虫阳性血清评估了... 对犬恶丝虫核苷二磷酸激酶(NDPK)基因的基本特征进行探究,并评估其诊断价值,旨在为犬恶丝虫病的诊断提供依据。本研究原核表达了Di-NDPK,通过生物信息学、免疫印迹和免疫荧光组化分析了该蛋白的基本特征,通过检测犬恶丝虫阳性血清评估了rDi-NDPK的诊断价值。免疫印迹显示,Di-NDPK具有良好的反应原性,免疫荧光组化显示,Di-NDPK在犬恶丝虫的侧索及肠上皮细胞和肠腔中分布。间接ELISA显示,该方法的敏感性为66.7%(16/24),特异性为38.9%(14/36),其中与犬细粒棘球蚴病阳性血清、犬钩虫病阳性血清以及犬弓首蛔虫病阳性血清发生交叉反应。Di-NDPK是一个分泌蛋白,但不适合作为犬恶丝虫病的诊断候选抗原。 展开更多

关键词 犬恶丝虫 NDPK基因 克隆 原核表达 免疫荧光定位

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日本血吸虫主要虫卵抗原Sjp40在感染新西兰白兔肝脏中的表达与免疫定位 被引量：1

4

作者 夏丹 邓淦明 +12 位作者 滕萍英 谢郁 李耀民 王春梅 陈淑洁 陈敏芳 麦荣嘉 廖海燕 石玲玉 欧丽妍 陈启伟 陈晓光 周晓红 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期826-831,共6页

目的观察Sjp40在感染新西兰白兔肝脏沉积虫卵及其肉芽肿病变形成中的表达情况,并进行免疫定位。方法日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔,收集未感染组、29 dpi组和45 dpi组肝脏,Trizol法提取各组肝脏总RNA,以日本血吸虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G... 目的观察Sjp40在感染新西兰白兔肝脏沉积虫卵及其肉芽肿病变形成中的表达情况,并进行免疫定位。方法日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔,收集未感染组、29 dpi组和45 dpi组肝脏,Trizol法提取各组肝脏总RNA,以日本血吸虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,Taqman探针q RT-PCR检测Sjp40 m RNA的表达;提取各组肝脏总蛋白,以硫酸铵盐析法和Protein G免疫亲和柱层析法纯化的抗Sjp40-Mc Ab 9G7和抗弓形虫t SAG1-Mc Ab Y3A8(对照抗体),western blot检测Sjp40蛋白的表达;制备肝脏石蜡切片,HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿的形成与发展,进一步以免疫荧光技术进行Sjp40在肝脏沉积虫卵及其肉芽肿组织中的定位。结果日本血吸虫感染兔呈急性肝肉芽肿病变期的45 dpi肝脏沉积虫卵中Sjp40 m RNA水平显著高于29 dpi尚未形成虫卵肉芽肿结节的肝脏沉积的未成熟虫卵(P<0.05),westernb blot证实了Sjp40蛋白在29 dpi和45 dpi兔肝脏中的表达。免疫荧光显示:Sjp40在29 dpi兔肝脏中定位于未成熟虫卵内,而45 dpi可见感染兔肝脏中沉积大量成簇内含毛蚴的成熟虫卵及其周围肉芽肿组织均有明显荧光。结论 Sjp40在日本血吸虫感染兔肝脏沉积虫卵中的转录水平随虫卵发育成熟而显著增加,在感染兔急性肉芽肿病变期(45dpi)呈现由虫卵向其周围肉芽肿组织扩散现象,提示该分子在血吸虫肉芽肿形成与发展过程中具有重要作用。 展开更多

关键词 日本血吸虫 血吸虫病 SjP40 虫卵肉芽肿 免疫荧光定位

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家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP14的鉴定

5

作者 马成 杨东林 +3 位作者 陈洁 潘国庆 李田 周泽扬 《蚕学通讯》 2025年第2期46-52,共7页

微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,在环境中以孢子形式存在。其成熟孢子的孢壁主要由蛋白质和几丁质组成,在维持孢子抗性、粘附宿主及促进发芽侵染等方面具有重要作用。基于前期孢壁蛋白质组质谱数据,本研究鉴定出一个新... 微孢子虫是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物,在环境中以孢子形式存在。其成熟孢子的孢壁主要由蛋白质和几丁质组成,在维持孢子抗性、粘附宿主及促进发芽侵染等方面具有重要作用。基于前期孢壁蛋白质组质谱数据,本研究鉴定出一个新的孢壁蛋白NbSWP14。该蛋白的开放阅读框长度为1269 bp,编码423个氨基酸,理论分子量为50 kDa,等电点为9.10,含有信号肽序列,生物信息学分析显示其具有较高的热稳定性。RT-PCR分析结果表明,NbSWP 14基因在家蚕微孢子虫感染家蚕后2~10天均持续转录。通过构建大肠埃希菌(Escherichia coli)E.coli Rosetta[pColdⅠ-NbSWP 14]重组菌,经原核表达和Ni柱亲和层析纯化获得重组蛋白,并成功制备了NbSWP14的多克隆抗体。免疫印迹分析证实家蚕微孢子虫孢子总蛋白中存在NbSWP14蛋白。间接免疫荧光实验结果显示,该蛋白定位于家蚕微孢子虫成熟孢子的孢壁上。本研究扩充了微孢子虫孢壁蛋白的组成信息,为后续开展NbSWP14蛋白的功能研究提供了重要基础。 展开更多

关键词 家蚕微孢子虫 孢壁蛋白 序列特征 免疫荧光定位

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中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位 被引量：12

6

作者 张林雅 谢冰花 +3 位作者 倪翠侠 赵磊 李红亮 商晗武 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1246-1254,共9页

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因,并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜... 【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因,并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱;利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列,命名为AcerOrco(GenBank登录号:JF968610.1),其全长为1434bp,编码477个氨基酸,预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示,AcerOrco在卵、幼虫和蛹期呈低丰度表达,1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达,且在1日龄的触角中表达量最高;采集蜂时期的触角、头(去除触角)、胸、腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示,AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达(尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高),而且常成对出现,并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite,OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长,获得了其表达谱,且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上,最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。 展开更多

关键词 中华蜜蜂 气味受体 表达谱分析 触角感器 免疫荧光定位

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柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用 被引量：2

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作者 李莎 梁思婷 +6 位作者 赵其平 韩红玉 朱顺海 翟颀 杨斯涵 黄兵 董辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第2期47-52,共6页

为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选... 为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8000和1:64 000。Western blot结果显示2F7抗体能识别柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中大小约为35 k Da的天然蛋白。利用该单抗对Et LDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布进行了定位,结果显示该蛋白主要分布于裂殖子的细胞质,表明成功地制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 乳酸脱氢酶 单克隆抗体 免疫荧光定位

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游仆虫EoRab2a蛋白的表达、纯化及定位分析

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作者 许静 李江姣 +2 位作者 聂宇 梁爱华 王伟 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期646-651,共6页

Rab GTPase家族蛋白是真核细胞内膜系统转运途径中重要的调控因子,不同的Rab家族成员在细胞具有功能多样性。为了解Rab2的功能,八肋游仆虫EoRab2a基因连接入原核表达质粒pGEX-6P-1中,获得重组表达质粒pGEX-6P-1-EoRab2a。质粒pGEX-6P-1-... Rab GTPase家族蛋白是真核细胞内膜系统转运途径中重要的调控因子,不同的Rab家族成员在细胞具有功能多样性。为了解Rab2的功能,八肋游仆虫EoRab2a基因连接入原核表达质粒pGEX-6P-1中,获得重组表达质粒pGEX-6P-1-EoRab2a。质粒pGEX-6P-1-EoRab2a转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,大肠杆菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EoRab2a高效表达了可溶性GST-EoRab2a蛋白。融合蛋白GST-EoRab2a经亲和层析获得电泳纯蛋白。纯化后的GST-EoRab2a免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。ELISA和Western blotting检测显示制备的抗体效价1∶25600,特异性良好。免疫荧光定位表明EoRab2a在游仆虫细胞质中点状分布,推测参与内质网与高尔基体间膜泡转运。 展开更多

关键词 八肋游仆虫 EoRab2a 原核表达 纯化 免疫荧光定位

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多头带绦虫dUTPase基因的原核表达、组织定位及酶学活性分析

9

作者 黄兴 徐璟 +6 位作者 王宇 杨应东 万洁 郭承 古小彬 谢跃 杨光友 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2374-2382,共9页

探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为44... 探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为447bp,编码148个氨基酸,预测的蛋白质分子大小为16.39ku,等电点为6.263;与猪囊尾蚴和豆状囊尾蚴dUTPase基因的氨基酸序列相似性分别为97%和91%。原核表达的TmdUTPase为可溶性蛋白,纯化后的蛋白质质量浓度为0.907mg·mL^(-1),Western blot分析显示,该蛋白质能够被山羊脑多头蚴阳性血清所识别,具有较强的反应原性。免疫荧光定位显示Tm-dUTPase主要分布于多头带绦虫成虫的体内实质区,同时广泛分布于多头带绦虫幼虫(脑多头蚴)的头节和包囊囊壁外层。酶学活性试验测得重组Tm-dUTPase的比活力为986.29U·mg^(-1),EDTA能够抑制Tm-dUTPase活性,而金属离子Mg^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)能够增强Tm-dUTPase活性。上述结果为进一步研究Tm-dUTPase基因的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 多头带绦虫 dUTPase基因 原核表达 酶学活性分析 免疫荧光定位

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毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的原核表达与定位分析 被引量：1

10

作者 叶状 王乐乐 +7 位作者 汪飞燕 刘悦 彭月梅 宿世杰 候照峰 许金俊 陶建平 刘丹丹 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1553-1561,共9页

旨在探析毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的功能。提取毒害艾美耳球虫扬州株配子体总RNA,应用RT-PCR获取EnOXIO1编码基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-EnOXIO1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),体外诱导表达,对重组蛋白进行抗原性分析,应用制... 旨在探析毒害艾美耳球虫氧化还原酶EnOXIO1的功能。提取毒害艾美耳球虫扬州株配子体总RNA,应用RT-PCR获取EnOXIO1编码基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-EnOXIO1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),体外诱导表达,对重组蛋白进行抗原性分析,应用制备的多抗进行激光共聚焦免疫荧光定位。结果显示,获得的EnOXIO1基因全长为2535 bp,体外重组表达的蛋白大小约100 ku,主要以包涵体的形式存在,表达量约为0.5 mg·mL^(-1)。Western blot分析结果显示,该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体识别,同时能被制备的鼠多抗以及毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明该重组蛋白具有较好的反应原性和交叉反应原性。激光共聚焦免疫荧光定位结果显示,EnOXIO1基因表达产物主要存在于配子体内的成壁体上,参与了卵囊壁的形成。本研究成功克隆和表达了毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白,并将其定位于配子体和卵囊壁上,为进一步解析EnOXIO1蛋白参与卵囊壁形成的分子机制奠定基础,为研制新型免疫阻断型球虫亚单位疫苗提供重要靶抗原。 展开更多

关键词 毒害艾美耳球虫 EnOXIO1 克隆表达 免疫荧光定位 功能鉴定

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PIN2蛋白在水稻根尖细胞中定位方法的优化

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作者 李琰 詹晓平 +2 位作者 杨静 刘林 李成云 《山东农业科学》 2015年第8期104-106,共3页

PIN2蛋白作为生长素外排蛋白,在植物根的向地性生长中起重要作用。免疫定位法是一种可以将蛋白在植物细胞中快速准确定位的方法。本研究利用改良的免疫荧光定位法,对PIN2蛋白在水稻根尖细胞中的定位进行了观察,并与前人的两种方法进行... PIN2蛋白作为生长素外排蛋白,在植物根的向地性生长中起重要作用。免疫定位法是一种可以将蛋白在植物细胞中快速准确定位的方法。本研究利用改良的免疫荧光定位法,对PIN2蛋白在水稻根尖细胞中的定位进行了观察,并与前人的两种方法进行比较。结果表明,与已有的方案比较,改良免疫荧光定位法可使PIN2蛋白在水稻根尖细胞中的位置快速准确地被观察到,且简化了操作步骤,操作方便快速,可广泛应用于植物其他蛋白的定位研究。 展开更多

关键词 PIN2蛋白 免疫荧光定位 水稻 根尖细胞

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果胶酶对灵武长枣果实发育中阿拉伯半乳糖蛋白分布的影响

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作者 王静 章英才 +1 位作者 陶珊珊 杨雪 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期62-74,共13页

以3种不同浓度的果胶酶处理灵武长枣(Ziziphus jujuba‘Lingwu Changzao’)4个不同发育时期的果实,采用免疫细胞化学技术,在细胞水平上对果实阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)表位进行原位分析,探讨果胶酶对其不同发育时期的果实中AGPs分布的影响... 以3种不同浓度的果胶酶处理灵武长枣(Ziziphus jujuba‘Lingwu Changzao’)4个不同发育时期的果实,采用免疫细胞化学技术,在细胞水平上对果实阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)表位进行原位分析,探讨果胶酶对其不同发育时期的果实中AGPs分布的影响,为明确果胶酶对果实成熟软化的影响提供解剖学依据。结果表明:JIM13、JIM8和MAC204抗体所标记的抗原荧光强弱在各时期果实的不同组织存在一定的差异。当果肉组织用较低浓度的果胶酶0.028 U·mL^(-1)(E1)处理,果皮组织结构没有明显的变化,果皮及内部薄壁细胞细胞壁表面和细胞间隙中的AGPs抗原表位减少;0.056 U·mL^(-1)(E2)和0.084 U·mL^(-1)(E3)浓度果胶酶处理的果实,果实组织细胞壁解体程度增加,果皮及内部薄壁细胞细胞壁中AGPs抗原表位检测量逐渐降低,果胶酶浓度的增加导致AGPs在果实所有表位排列的更大影响和较低的荧光信号。经果胶酶最高浓度0.084 U·mL^(-1)(E3)处理后,Calcofluor White染色显示细胞壁区域荧光也不同程度减弱或降低,AGPs分布的紊乱和抗原表位的缺失与细胞中纤维素组装的变化有关。比较分析表明,不同发育时期的果实AGPs碳水化合物的分布不同,这与组织结构的变化有关;果胶酶作用下AGPs聚糖链的缺失导致细胞壁组分之间的相关性建立和细胞壁结构的重塑受阻,诱导了整个细胞壁结构的改变,影响了果实的成熟。 展开更多

关键词 果胶酶 灵武长枣 果实 阿拉伯半乳糖蛋白 免疫荧光定位

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毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的原核表达与分析 被引量：1

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作者 彭月梅 叶状 +7 位作者 汪飞燕 王礼跃 冯永翠 王乐乐 候照峰 许金俊 陶建平 刘丹丹 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期846-853,共8页

旨在研究毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的反应原性及其在虫体内的亚细胞定位。提取毒害艾美耳球虫(扬州株)配子体总RNA,RT-PCR扩增En GPX的ORF编码序列,构建原核表达质粒pET-28a(+)-En GPX,转化至BL21(DE3)进行体外诱导表达,... 旨在研究毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX的反应原性及其在虫体内的亚细胞定位。提取毒害艾美耳球虫(扬州株)配子体总RNA,RT-PCR扩增En GPX的ORF编码序列,构建原核表达质粒pET-28a(+)-En GPX,转化至BL21(DE3)进行体外诱导表达,同时制备鼠抗rEnGPX多克隆抗体,对重组蛋白进行Western blot反应原性分析和激光共聚焦免疫荧光定位分析。结果表明,En GPX ORF序列全长753 bp,编码250个氨基酸,体外重组表达蛋白大小约30 ku,主要以包涵体形式存在。该重组蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体,鼠抗rEnGPX多克隆抗体,毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别,表明其具有较好的反应原性和交叉反应原性。在天然配子体蛋白中检测出EnGPX,其编码蛋白主要分布于配子体内的Ⅱ型成壁体(WFBII)及卵囊壁上。本研究成功克隆表达了毒害艾美耳球虫谷胱甘肽过氧化物酶EnGPX,验证其具有良好的反应原性,并定位于配子体及卵囊壁上。以期为研究En GPX参与卵囊壁形成的分子机制提供新的线索,也为研制新型球虫亚单位疫苗提供新的靶标。 展开更多

关键词 毒害艾美耳球虫 EnGPX 克隆表达 反应原性 免疫荧光定位

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增强UV-B辐射和He-Ne激光对小麦原生质体微管骨架的影响 被引量：9

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作者 郭爱华 高丽美 +1 位作者 李永锋 韩榕 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期250-255,共6页

以小麦叶片原生质体为材料,采用间接免疫荧光定位法标记其微管系统,并利用激光共聚焦扫描显微系统进行观察。研究了低剂量He-Ne激光(5mW.mm-2)、增强UV-B辐射(10.08kJ.m-2.d-1)及二者的复合处理对小麦幼苗叶肉细胞中微管骨架的影响。结... 以小麦叶片原生质体为材料,采用间接免疫荧光定位法标记其微管系统,并利用激光共聚焦扫描显微系统进行观察。研究了低剂量He-Ne激光(5mW.mm-2)、增强UV-B辐射(10.08kJ.m-2.d-1)及二者的复合处理对小麦幼苗叶肉细胞中微管骨架的影响。结果表明,增强UV-B辐射后,小麦叶片细胞中微管骨架发生解聚,呈短棒状或点状分布,微管束弥散且荧光强度减弱;而增强UV-B辐射后再施以He-Ne激光处理,小麦叶肉细胞微管骨架有部分断裂,但较单独UV-B处理组的损伤程度轻,说明低剂量的He-Ne激光可以部分修复增强UV-B辐射对微管骨架的损伤,且对微管的聚合有促进作用。 展开更多

关键词 微管骨架 免疫荧光定位 小麦 HE-NE激光 UV-B辐射

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微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21的原核表达及鉴定

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作者 任保彦 陈玉兰 +7 位作者 宫鹏涛 李巍 李建华 苏利波 李赫 杨举 刁玉梅 张西臣 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1140-1144,共5页

本研究旨在克隆微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21开放阅读框,构建其原核表达质粒,并对获得的融合蛋白进行鉴定。从含CP21基因的噬菌体中提取模板DNA,PCR扩增基因片段,构建pET-28a-CP21原核表达质粒,转化至埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中,I... 本研究旨在克隆微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21开放阅读框,构建其原核表达质粒,并对获得的融合蛋白进行鉴定。从含CP21基因的噬菌体中提取模板DNA,PCR扩增基因片段,构建pET-28a-CP21原核表达质粒,转化至埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。用原核表达蛋白免疫小鼠,制备抗重组蛋白多抗,对蛋白进行定位。结果表明成功扩增出CP21基因,并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌中表达出相对分子质量为25 ku的融合蛋白,Western blotting证明表达的CP21融合蛋白能与抗C.parvum多克隆抗体产生特异性反应。免疫荧光结果表明:CP21基因在子孢子和卵囊期均表达,且表达产物位于子孢子表膜和卵囊壁表面。CP21是一种与侵入机制有关的黏附相关蛋白。研究结果为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制奠定了基础。 展开更多

关键词 微小隐孢子虫 CP21 黏附相关蛋白 原核表达 免疫荧光定位

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Hira基因产物在银鲫和彩鲫卵子发生过程中的动态变化 被引量：5

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作者 郭秋红 赵占克 +1 位作者 王玉凤 桂建芳 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期611-617,共7页

为进一步研究Hira基因在卵子发生和雌核发育过程中的作用,通过原位杂交和免疫荧光定位的方法检测了Hira mRNA和蛋白质在雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫卵子发生过程中的动态变化。结果表明,银鲫和彩鲫卵子发生过程中Hira基因转录产物的变... 为进一步研究Hira基因在卵子发生和雌核发育过程中的作用,通过原位杂交和免疫荧光定位的方法检测了Hira mRNA和蛋白质在雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫卵子发生过程中的动态变化。结果表明,银鲫和彩鲫卵子发生过程中Hira基因转录产物的变化基本一致,在Ⅰ期卵母细胞的细胞核中大量表达,至Ⅱ期卵母细胞时转至细胞质中均匀分布,在Ⅲ期卵母细胞中,杂交信号逐渐移向细胞的周边,到Ⅳ期时随着卵黄物质大量积累,杂交信号几乎不见。HIRA蛋白在银鲫和彩鲫卵子发生过程中的变化略有差别。HIRA蛋白在银鲫Ⅰ期卵母细胞中没有表达,在Ⅱ期卵母细胞的细胞质中有弱表达,在Ⅲ期早期卵母细胞的周边有强烈表达;而在彩鲫Ⅰ期卵母细胞中就有HIRA蛋白的弱表达,至Ⅱ期时HIRA蛋白在细胞质中大量表达,Ⅲ期早期卵母细胞的细胞质中有弱表达。在银鲫和彩鲫Ⅲ期末和Ⅳ期卵母细胞中都很难观察到荧光信号。Hira mRNA和蛋白质在银鲫和彩鲫早期卵母细胞中有较强表达,且在银鲫和彩鲫卵子发生过程中没有显著差异,说明其可能对于脊椎动物卵子发生和减数分裂没有显著影响,而是在受精和/或胚胎发育过程中起作用。 展开更多

关键词 雌核发育银鲫 两性生殖彩鲫 卵子发生 Hira基因 原位杂交 免疫荧光定位

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细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达及诊断价值的初步评价 被引量：5

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作者 吴茂迪 宋星桔 +6 位作者 闫敏 阳爱国 郭莉 王凝 谢跃 古小彬 杨光友 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期572-579,共8页

探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并... 探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并以绵羊细粒棘球蚴阳性血清评价Eg-cystatin重组蛋白的诊断价值。结果如下:Eg-cystatin生物信息学分析结果显示,该蛋白质含有一个N端信号肽以及cystatin结构域,是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制剂,进化树分析显示Eg-cystatin属于绦虫cystatinⅡ型,并且与其他绦虫的cystatin相似性为72.20%~80.66%,免疫荧光定位发现该蛋白质主要分布在原头蚴的表皮和顶突钩,生发层,成虫虫体内部和虫卵。基于Eg-cystatin建立的间接ELISA方法的特异性为79.1%,敏感性为83.3%,与剖检符合率为81.25%。Eg-cystatin在成虫和幼虫时期均有表达,提示该基因与虫体生命活动息息相关,但Eg-cystatin蛋白不适合作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原候选。 展开更多

关键词 细粒棘球绦虫 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 酶联免疫吸附试验 免疫荧光定位

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应用生物素标记和蛋白质组学方法分离鉴定柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)的表面蛋白 被引量：2

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作者 赵唯希 王林玲 +2 位作者 刘泽锋 周泽扬 李治 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期669-676,共8页

建立灵敏、特异、稳定的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)表面蛋白分离鉴定技术,对研究其侵染机制和早期检测技术非常重要。采用生物素Sulfo-NHS-SS-biotin能特异性标记柞蚕微孢子虫的表面蛋白;经生物素标记后的微孢子虫用0.01 mol/L NaOH和... 建立灵敏、特异、稳定的柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)表面蛋白分离鉴定技术,对研究其侵染机制和早期检测技术非常重要。采用生物素Sulfo-NHS-SS-biotin能特异性标记柞蚕微孢子虫的表面蛋白;经生物素标记后的微孢子虫用0.01 mol/L NaOH和2%SDS的混合液裂解结合超声波破碎的方法能提取到更多的微孢子虫总蛋白质;用30%乙腈和70%甲酸配合沸水浴处理可有效洗脱微孢子虫表面蛋白。对得到的柞蚕微孢子虫表面蛋白检测样品进行LC-MS/MS质谱鉴定,共获得了8个假定的表面蛋白,其中分子质量为26.6 k D(Np SWP12)、25.7 k D(Np SWP26)、32.0 kD(Np SWP30)的3个假定蛋白经间接免疫荧光分析确证为定位在孢子表面的蛋白质。序列分析显示,NpSWP12、NpSWP26、NpSWP30与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白NbSWP12、NbSWP26、NbSWP30的氨基酸序列相似度分别为100%、93%、79%,其中Np SWP26无N-糖基化位点和O-糖基化位点,但C端具有介导孢子粘附宿主细胞的肝素结合基序。分离鉴定的3个表面蛋白可以作为柞蚕微孢子虫侵染机制研究和早期检测的靶标蛋白。 展开更多

关键词 柞蚕微孢子虫 表面蛋白 生物素-亲和素系统 液相色谱-二级质谱连用 间接免疫荧光定位

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旋毛虫Serpin基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化及虫体表达特性 被引量：1

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作者 张煜涵 刘照琨 +7 位作者 毕磊 关靖喆 毛贻贤 李达 马静 路丽群 张思远 路义鑫 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2017年第9期13-15,I0002,共4页

为研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin),基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化,本研究应用实时荧光定量PCR技术对不同发育时期的虫体的Serpin在mRNA表达水平进行检测。同时利用鼠抗重组蛋白血清对Serpin在旋毛虫成虫、新生幼虫、成... 为研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin),基因在不同发育时期的mRNA表达水平变化,本研究应用实时荧光定量PCR技术对不同发育时期的虫体的Serpin在mRNA表达水平进行检测。同时利用鼠抗重组蛋白血清对Serpin在旋毛虫成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫及肌幼虫中进行定位,以鉴定该Serpin基因的表达特性。研究结果显示,在成虫时期,3 d时表达量明显高于6 h和5 d的表达量(P﹤0.05);成囊前期表达量很低,其中18 d时表达量最低(P﹤0.05);肌幼虫时期在26 d、38 d和48 d均有大量表达(P﹤0.05)。免疫荧光染色结果表明,Ts Serpin蛋白在5 d成虫期的体表表达;在新生幼虫和14 d成囊前期幼虫的体内体表均有表达;38 d肌幼虫时期明显可见表皮及体内均有表达。本实验为探究旋毛虫在宿主体内免疫逃避机制奠定基础。 展开更多

关键词 旋毛虫 丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin) 实时荧光定量PCR 免疫荧光定位

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犬恶丝虫天冬氨酸转氨酶基因的原核表达及分析

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作者 刘梅 兰景超 +8 位作者 王宇 林海 张志和 王成东 罗娌 刘理 古小彬 汪涛 杨光友 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期700-705,共6页

目的了解犬恶丝虫天冬氨酸转氨酶(AspAT)基因特征及其在虫体的定位,对犬恶丝虫AspAT(DiAspAT)基因进行了原核表达和免疫荧光定位分析。方法从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选到DiAspAT基因序列,通过RT-PCR方法克隆DiAspAT基因,利用相关... 目的了解犬恶丝虫天冬氨酸转氨酶(AspAT)基因特征及其在虫体的定位,对犬恶丝虫AspAT(DiAspAT)基因进行了原核表达和免疫荧光定位分析。方法从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选到DiAspAT基因序列,通过RT-PCR方法克隆DiAspAT基因,利用相关软件进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET32a(+)-AspAT并进行诱导表达;表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后进行Western blotting分析;通过免疫组化技术观察DiAspAT蛋白在犬恶丝虫虫体内的定位分布。结果 DiAspAT基因的ORF框长度为1 221bp,编码406个氨基酸,理论相对分子量45.731 8kDa,等电点为8.05,表达的重组蛋白约为64kDa;Western blotting显示AspAT重组蛋白能被犬恶丝虫阳性血清识别;间接免疫荧光染色结果显示,DiAspAT在犬恶丝虫的侧索、皮下组织、肌细胞、假体腔壁、子宫及肠上皮、发育的胚胎中分布。结论成功克隆和表达了DiAspAT基因,并完成DiAspAT在雌性犬恶丝虫成虫上的定位,为进一步了解犬恶丝虫的生理代谢及犬恶丝虫病的诊断和防控奠定基础。 展开更多

关键词 犬恶丝虫 AspAT基因 克隆 原核表达 免疫荧光定位

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