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人免疫球蛋白G酶解制备Fab和Fc片段及其分离纯化 被引量：8
1
作者 唐思远 林东强 +1 位作者 童红飞 姚善泾 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第5期1750-1756,共7页
为了制备抗体Fab和Fc片段,采用木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G(IgG),通过优化酶解条件和色谱法分离过程,得到了纯度较高的Fab片段和Fc片段。考察了酶解pH、酶加入量、添加半胱氨酸和酶解时间等对IgG酶解过程的影响,优化了酶解条件,提高酶... 为了制备抗体Fab和Fc片段,采用木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G(IgG),通过优化酶解条件和色谱法分离过程,得到了纯度较高的Fab片段和Fc片段。考察了酶解pH、酶加入量、添加半胱氨酸和酶解时间等对IgG酶解过程的影响,优化了酶解条件,提高酶解效率,IgG转化率大于98%。酶解产物通过Protein A亲和色谱法和DEAE阴离子交换色谱法进行了纯化,分离得到Fc片段和Fab片段,收率分别为72.6%和40.1%。经SEC-HPLC分析,Fc片段纯度达95.7%,Fab片段纯度达96.6%。 展开更多
关键词 人免疫球蛋白G Fc片段 fab片段 木瓜蛋白酶 亲和色谱法 离子交换色谱法
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抗HBs Fab-IFNα融合蛋白的制备与初步鉴定
2
作者 陆慧琦 宋杰 +1 位作者 叶伟民 韩焕兴 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期467-470,共4页
目的构建抗HBsAg的pComb Fab-IFNα载体,原核表达具双重生物活性的抗HBs Fab-IFNα融合蛋白。方法以pBAD-Fab和pBADIFNα作为模板,分别扩增Fd、λ和IFNα基因,经相应的限制性内切酶酶切后分3次克隆入pComBHss质粒,转化XL-1 Blue大肠埃... 目的构建抗HBsAg的pComb Fab-IFNα载体,原核表达具双重生物活性的抗HBs Fab-IFNα融合蛋白。方法以pBAD-Fab和pBADIFNα作为模板,分别扩增Fd、λ和IFNα基因,经相应的限制性内切酶酶切后分3次克隆入pComBHss质粒,转化XL-1 Blue大肠埃希菌。限制性酶切和测序鉴定重组质粒,免疫蛋白印迹（Western blotting）和斑点印迹（Dot blotting）鉴定融合蛋白的表达及抗原结合活性。结果重组载体的酶切、电泳及测序表明抗HBs Fab-IFNα基因克隆正确。表达产物经12%SDS-PAGE电泳、转印,Western blotting显示该融合蛋白分子量约为65kD,Dot blotting显示其与HBsAg具有结合能力。细胞病变抑制法测定IFNα生物学活性为7.8×1045.1×105U/ml。结论该原核系统成功表达了抗HBs Fab-IFNα融合蛋白,表明其既具有抗HBsAg结合能力,又具备IFNα的生物活性,为进一步的系统表达和应用研究提供了条件。 展开更多
关键词 免疫球蛋白fab碎片 干扰素Α 肝炎表面抗原 乙型 肝炎病毒 乙型
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基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立
3
作者 李常颖 李宏杰 畅继武 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期534-536,共3页
目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至... 目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 免疫球蛋白类 fab 白细胞介素2
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小鼠抗天花粉蛋白IgE型单抗的酶解及其Fab的制备
4
作者 何贤辉 柯一保 +3 位作者 孙汛 蔡迎春 季永镛 聂慧玲 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期697-701,共5页
研究了Ｐａｐａｉｎ及Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解小鼠抗天花粉蛋白ＩｇＥ单抗的条件及Ｆａｂ的制备。Ｐａｐａｉｎ和Ｔｒｙｐｓｉｎ两者都可产生Ｆ（ａｂ′）_２，分子量在１５０～１６０ｋＤ左右；经Ｐａｐａｉｎ裂解的主要产物中还有Ｆａｂ... 研究了Ｐａｐａｉｎ及Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解小鼠抗天花粉蛋白ＩｇＥ单抗的条件及Ｆａｂ的制备。Ｐａｐａｉｎ和Ｔｒｙｐｓｉｎ两者都可产生Ｆ（ａｂ′）_２，分子量在１５０～１６０ｋＤ左右；经Ｐａｐａｉｎ裂解的主要产物中还有Ｆａｂ，分子量７２ｋＤ，可通过凝胶过滤获得纯的Ｆａｂ。而Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解物经ＤＴＴ还原、碘乙酰胺烷化虽然也可得到Ｆａｂ′（ｔ），但不易纯化；可见，要制备Ｆａｂ以采用Ｐａｐａｉｎ裂解为好，而制备Ｆ（ａｂ′）_２则可采用Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解。这二个酶的裂解速度是Ｔｒｙｐｓｉｎ大于Ｐａｐａｉｎ。 展开更多
关键词 免疫球蛋白E 酶解 fab 天花粉蛋白 单克隆抗体
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非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数 被引量：11
5
作者 郑大勇 罗荣城 韩焕兴 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期110-112,119,共4页
目的　测定完全人源化基因工程抗体HBsAgFab的亲和常数。方法　采用非竞争性ELISA固相法 ,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后 ,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAgFab及完整抗体抗HBsAgIgG的抗原抗体... 目的　测定完全人源化基因工程抗体HBsAgFab的亲和常数。方法　采用非竞争性ELISA固相法 ,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后 ,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAgFab及完整抗体抗HBsAgIgG的抗原抗体结合反应曲线 ,计算出抗HBsAgFab及抗HBsAgIgG的亲和常数。结果　人源基因工程抗体抗HBsAgFab的功能性亲和常数在 10 7～10 8M 1水平 ,比完整抗HBsAgIgG仅仅小约 1个数量级 (10 8～ 10 9M 1)。结论　该基因工程抗体与抗原结合能力较强 ,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础。 展开更多
关键词 酶联免疫吸附测定 肝炎表面抗原 乙型 免疫球蛋白类 fab 抗体亲和力
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天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析 被引量：5
6
作者 邵红霞 章黎 +4 位作者 杨彬 冯萌 付永峰 Hiroshi Tachibana 程训佳 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1007-1010,1015,共5页
目的:构建天然人源IgGFab噬菌体抗体库并分析来源于健康人外周血B淋巴细胞的抗体基因可变区的多样性及优势选择。方法:以DNA重组技术从300名健康志愿者的外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链及重链Fd基因,分别插入噬菌体载体pFabICN... 目的:构建天然人源IgGFab噬菌体抗体库并分析来源于健康人外周血B淋巴细胞的抗体基因可变区的多样性及优势选择。方法:以DNA重组技术从300名健康志愿者的外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链及重链Fd基因,分别插入噬菌体载体pFabICN相应位置,构建天然人源免疫球蛋白G基因文库;进一步从抗体库中随机挑选克隆,获得重轻链基因进行核苷酸序列测定并利用IgBLAST数据库分析抗体基因可变区的同源家族。结果:从4×108库容的天然人源IgGFab噬菌体抗体库中随机挑选克隆,对其中32个轻链及重链Fd基因插入正确的克隆进行核苷酸序列测定和氨基酸序列的推算,获得29条彼此完全不同的Fd重链基因及轻链基因。以IgBLAST数据库比对分析显示29条重链基因的V区分别属于VH3(72.4%),VH1(10.3%),VH4(6.9%),VH5(6.9%)和VH7(3.4%)基因家族。29条轻链基因分别属于Vκ1(44.8%),Vκ2(15.4%),Vκ3(11.5%),Vκ4(23.1%)基因家族和Vλ1(11.5%)基因家族。结论:以300份健康人外周血淋巴细胞的抗体基因构建的天然人源IgGFab噬菌体抗体库基因多样性良好,重链VH3基因家族存在优势表达。 展开更多
关键词 噬菌体展示库 免疫球蛋白fab片段 免疫球蛋白重链基因 抗体多样性
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抗膀胱癌单抗Fab段基因的克隆及表达 被引量：3
7
作者 周丽君 王琰 +2 位作者 白银 张海荣 余莉章 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2002年第2期117-121,共5页
目的:克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆k链和Fd段基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab;运用PCR介导... 目的:克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆k链和Fd段基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab;运用PCR介导的定位点突变改造V_H氨基端序列;用ELISA、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果:从分泌抗膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆了重链Fd段和k链基因,在大肠杆菌中获得有抗原结合活性的噬菌体抗体和可溶性Fab的表达,但活性很弱,将V_H氨基端序列矫正为亲本单抗原始序列后,明显改善了其活性,通过ELISA、免疫组化及模拟抗体库筛选证实了所获抗体片段的特异性结合及在抗体库技术中的可用性。结论:获得了功能性抗膀胱癌小分子抗体,并再次提示抗体氨基端序列对抗体活性的影响的重要性。 展开更多
关键词 克隆 表达 抗膀胱癌单抗 免疫球蛋白可变区基因 fab 膀胱癌
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人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究
8
作者 郑大勇 罗荣城 韩焕兴 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期1022-1024,共3页
目的　探讨表达人源抗HBsAgFab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法 ,以期大量获取人源抗HBsAgFab。方法　在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律 ,筛选最佳的培养模式及诱导表达条件 ,后于发酵罐中行补料高密度发酵试验 ,以... 目的　探讨表达人源抗HBsAgFab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法 ,以期大量获取人源抗HBsAgFab。方法　在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律 ,筛选最佳的培养模式及诱导表达条件 ,后于发酵罐中行补料高密度发酵试验 ,以确定最佳补料模式。结果　由摇瓶发酵获得的数据表明 ,当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点 ,在 2 5℃下以 0 2 %arabinose诱导12h条件下Fab的产率最佳 ,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大OD60 0 达到 5 5 2 ,相当于湿菌含量 110g/L水平。同时 ,经证实Fab的抗原结合活性良好。结论　确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 。 展开更多
关键词 基因工程抗体 免疫球蛋白类 fab 大肠杆菌 发酵 优化表达
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胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定 被引量：1
9
作者 甄云凤 李常颖 +1 位作者 畅继武 朱铁虹 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1112-1115,共4页
目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性。方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,... 目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性。方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性。结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带。ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性。结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 胰淀素 噬菌体抗体库 免疫球蛋白类 fab 鉴定
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