旨在建立鹅催乳素(Goose prolactin,gPRL)的高灵敏度的测定方法。本研究设计出基于PRLR-JAKSTAT5信号通路的荧光素酶报告基因系统。首先克隆鹅PRLR基因CDS区序列,合成信号转导和转录激活因子5(Signal transducer and activator of trans...旨在建立鹅催乳素(Goose prolactin,gPRL)的高灵敏度的测定方法。本研究设计出基于PRLR-JAKSTAT5信号通路的荧光素酶报告基因系统。首先克隆鹅PRLR基因CDS区序列,合成信号转导和转录激活因子5(Signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)信号应答序列,并分别插入真核表达载体pCMV6-Entry和荧光素酶报告载体pGL3-Enhancer中,构建成为信号接收载体和信号应答载体。然后将两载体同筛选基因载体pEZX-MR03及内参载体pRL-TK共转染到HEK293T细胞中,经嘌呤霉素筛选后获得稳定转染的转基因细胞株。分别用终浓度为0、30、60、90ng·mL^(-1)的PRL刺激转基因细胞,通过qRT-PCR和双荧光素酶检测系统测定在不同PRL浓度下转基因细胞株中荧光素酶(Luciferase,Luc)基因的相对表达量和相对活性的变化。筛选出10株成功整合有全部4个转基因载体的转基因细胞株,经过不同浓度PRL刺激后,筛选出一株细胞,其荧光素酶基因表达量和酶活性均表现出随PRL浓度升高而上调的趋势。结果表明,建立的基于PRLR-JAK-STAT5信号传导系统检测鹅PRL生物活性的新方法是可行的,为准确测定家禽PRL奠定基础。展开更多
文摘旨在建立鹅催乳素(Goose prolactin,gPRL)的高灵敏度的测定方法。本研究设计出基于PRLR-JAKSTAT5信号通路的荧光素酶报告基因系统。首先克隆鹅PRLR基因CDS区序列,合成信号转导和转录激活因子5(Signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)信号应答序列,并分别插入真核表达载体pCMV6-Entry和荧光素酶报告载体pGL3-Enhancer中,构建成为信号接收载体和信号应答载体。然后将两载体同筛选基因载体pEZX-MR03及内参载体pRL-TK共转染到HEK293T细胞中,经嘌呤霉素筛选后获得稳定转染的转基因细胞株。分别用终浓度为0、30、60、90ng·mL^(-1)的PRL刺激转基因细胞,通过qRT-PCR和双荧光素酶检测系统测定在不同PRL浓度下转基因细胞株中荧光素酶(Luciferase,Luc)基因的相对表达量和相对活性的变化。筛选出10株成功整合有全部4个转基因载体的转基因细胞株,经过不同浓度PRL刺激后,筛选出一株细胞,其荧光素酶基因表达量和酶活性均表现出随PRL浓度升高而上调的趋势。结果表明,建立的基于PRLR-JAK-STAT5信号传导系统检测鹅PRL生物活性的新方法是可行的,为准确测定家禽PRL奠定基础。
