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p75NTR受体过表达对人RPE细胞氧化应激损伤的促进作用 被引量：2
1
作者 齐赟 白玉婧 +1 位作者 黎晓新 石璇 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期17-23,共7页
背景脉络膜新生血管（CNV）是多种眼底疾病致盲的病理基础，视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激损伤在CNV生成中具有重要作用。RPE氧化应激损伤能激活肿瘤坏死因子超家族的p75NTR受体，引起血管内皮细胞增生，但其调控机制尚未明确。 ... 背景脉络膜新生血管（CNV）是多种眼底疾病致盲的病理基础，视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激损伤在CNV生成中具有重要作用。RPE氧化应激损伤能激活肿瘤坏死因子超家族的p75NTR受体，引起血管内皮细胞增生，但其调控机制尚未明确。 目的探讨RPE细胞中p75NTR受体在CNV形成过程中的作用，并对其作用机制进行分析。 方法体外培养人RPE细胞（ARPE19细胞系），用p75NTR受体过表达质粒转染RPE细胞，分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法进行转染细胞中p75NTR受体基因和蛋白水平检测，以未转染p75NTR受体过表达质粒的RPE细胞作为对照组。采用BrdU法检测各组细胞的增生活性；采用Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率；用H2DCFDA荧光法和流式细胞计数检测细胞内活性氧簇（ROS）阳性百分数；采用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞线粒体标志物的表达（膜电位）及细胞色素C的表达；采用Western blot法检测和比较各组细胞中裂解caspase-3、Fas及血管内皮生长因子165（VEGF165）蛋白的相对表达水平。 结果p75NTR受体质粒转染组细胞中p75NTR受体的mRNA及蛋白表达量分别是对照组的（6.11±0.77）倍和（7.42±0.48）倍，差异均有统计学意义（t＝11.49、23.17，均P〈0.01）。BrdU法检测结果显示，p75NTR受体质粒转染12、24、36和48 h组细胞的增生活性（A值）率分别为（93.12±0.56）%、（86.30±0.66）%、（72.53±0.86）%和（60.77±2.81）%，对照组为100%，随着p75NTR受体质粒转染时间的延长，RPE细胞活性值逐渐减低，细胞凋亡百分数明显增加，与对照组比较差异均有统计学意义（均P〈0.05）。p75NTR受体质粒转染组转染后48 h，RPE细胞内ROS相对荧光强度为对照组的2.4倍，差异有统计学意义（t＝16.45，P〈0.01）；对照组RPE细胞中线粒体标志物阳性细胞比例为100%，而p75NTR受体质粒转染组细胞中线粒体标志物阳性细胞比例为（37.30±2.06）%，2个组比较差异有统计学意义（t＝57.71，P〈0.01）。p75NTR受体质粒转染组RPE细胞中细胞色素C的荧光强度明显高于对照组，与对照组比较，p75NTR受体质粒转染组RPE细胞中裂解caspase-3、Fas及VEGF165蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。 结论p75NTR受体过表达引起RPE细胞线粒体损伤及细胞凋亡，同时刺激RPE细胞分泌血管生成因子，促进CNV的形成。p75NTR受体可能是调控RPE损伤的另一个重要通路。 展开更多
关键词 神经生长因子受体/代谢 氧化应激 眼色素上皮/病理 脉络膜新生血管 人 信号转导/生理 p75NTR受体
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miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能的抑制作用及其机制
2
作者 朱江 任梅 许治国 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期695-702,共8页
背景研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附,并对肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)含量的变化进行调控,进而影响血管的生成,但miR-375是否于预视网膜新生血管的形成鲜见报道。目的探讨miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血... 背景研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附,并对肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)含量的变化进行调控,进而影响血管的生成,但miR-375是否于预视网膜新生血管的形成鲜见报道。目的探讨miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)功能的影响及其可能的作用机制。方法用IMDM完全培养液培养HRCECs,并将细胞分为正常对照组、CoCl_(2)处理组、CoCl_(2)+miR-375拟似剂组、CoCl_(2)+miR-375拟似剂对照组、CoCl_(2)+miR-375抑制剂组和CoCl_(2)+miR-375抑制剂对照组,待细胞生长至对数生长期后用200μmol/LCoCl_(2)处理HRCECs以制备缺氧细胞模型;制备终浓度为50nmol/L的miRNA-脂质体复合物和小干扰RNA(siRNA)-脂质体复合物将miR-375和卷曲蛋白4(FZD4)siRNA转染各组细胞48h。采用MTT法检测各组细胞的增生情况(A值)并计算增生倍数;采用Transwell小室法检测各组迁移的细胞数目;采用ELISA法检测细胞培养液中VEGF和血管内皮钙黏蛋白(VE—cadherin)含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR.375mRNA和FZD4mRNA的相对表达量变化;采用Westernblot法分析细胞中Wnt通路相关蛋白的相对表达量变化;采用Matrigel小管形成实验检测细胞的体外形成血管的长度。将培养的细胞分为正常对照组、CoCl_(2)处理组、CoCl_(2)+mock组和CoCl_(2)+FZD4siRNA组,采用荧光素酶报告基因法探测miR-375靶基因FZD4的表达。结果miR-375处理组miR-375mRNA相对表达量明显高于正常对照组,miR-375拟似剂组细胞中miR-375mRNA相对表达量明显高于miR-375拟似剂对照组,miR-375抑制剂组细胞中miR-375mRNA相对表达量明显低于miR-375抑制剂对照组,差异均有统计学意义(t=-19.237、8.764,均P〈0.01),提示miR-375的转染效率较高。正常对照组、CoCl_(2)处理组、CoCl_(2)+miR-375拟似剂组、CoCl_(2)+miR-375拟似剂对照组、CoCl_(2)+miR-375抑制剂组、CoCl_(2)+miR.375抑制剂对照组间细胞增生倍数、迁移细胞数、细胞培养液中VEGF和VE—Cadherin含量以及体外小管形成长度的总体比较差异均有统计学意义(F=24.324、26.776、14.113、19.225、15.040,均P〈0.001),CoCl2+miR-375拟似剂组细胞增生倍数、迁移细胞数体外小管形成长度及细胞分泌VEGF和VE—cadherin量均较CoCl_(2)+miR-375拟似剂对照组明显减少,而CoCl_(2)+miR-375抑制剂组较CoCl_(2)+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P〈0.01)。正常对照组、CoCl_(2)处理组、CoCl_(2)+miR-375拟似剂组、CoCl_(2)+miR-375拟似剂对照组、CoCl_(2)+miR-375抑制剂组、CoCl_(2)+miR-375抑制剂对照组细胞中B—catenin、cyclinD1、MMP2和VEGF蛋白表达量的总体比较差异均有统计学意义(F=11.753、13.283、16.770、10.334,均P〈0.001),CoCl_(2)+miR-375拟似剂组细胞中B.catenin、cyclinDl、MMP2、VEGF蛋白表达量较CoCl2+miR-375拟似剂对照组均明显下降,CoCl_(2)+miR-375抑制剂组较CoCl2+miR-375抑制剂对照组明显增加,差异均有统计学意义(均P〈0.01)。CoCl_(2)处理组和CoCl_(2)+mock组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均较正常对照组明显增加,CoCl2+FZD4siRNA组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均明显低于CoCl_(2)+mock组,差异均有统计学意义(均P〈0.05)。结论miR-375抑制缺氧条件下HRCECs的增生、迁移以及血管形成能力,其作用机制与miR-375直接靶向FZD4调控Wnt通路活性有关。 展开更多
关键词 微小RNA/生理 视网膜 血管内皮细胞 病理性新生血管形成 信号转导/生理 Wnt相关蛋白/代谢 细胞增生/药物作用 基因表达调控
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