LAMP耦合荧光侧向流层析试纸条的空间微生物快速检测技术 被引量：3

1

作者 韩培 侯红渠 +4 位作者 樊云龙 王文甲 吕雪飞 张伟 李晓琼 《空间科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期302-309,共8页

微生物种类及其含量监测是空间站内微生物控制的重要环节。但是空间环境的微重力条件及对资源的条件限制导致地面常规检测实验难以开展,因此在轨微生物检测主要依靠培养法。基于侧流层析试纸条的生物分子识别检测方法具有不受微重力环... 微生物种类及其含量监测是空间站内微生物控制的重要环节。但是空间环境的微重力条件及对资源的条件限制导致地面常规检测实验难以开展,因此在轨微生物检测主要依靠培养法。基于侧流层析试纸条的生物分子识别检测方法具有不受微重力环境影响的优点,耦合荧光检测方法可以达到较高的检测灵敏度,是在轨微生物检测的潜在方法之一。针对空间环境中对航天员生活环境及仪器仪表设备具有潜在危害的微生物,研究了一种基于环介导等温扩增(LAMP)耦合荧光侧流层析试纸条的微生物核酸鉴别技术。研究结果表明,该技术可实现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等空间站常见有害微生物的高灵敏、高特异性、快速检测,检测时间小于60 min,灵敏度达到100 copy·μL^(–1)。 展开更多

关键词 空间微生物 侧流层析试纸条 环介导等温扩增

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重组酶聚合酶扩增反应结合侧流层析试纸条技术快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪 被引量：2

2

作者 王慧芳 喻勇新 +3 位作者 李晨虹 陈文隽 凌岚馨 周颖 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2022年第17期291-297,共7页

建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计... 建立了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification,RPA)结合侧流层析试纸条技术(RPA-lateral flow dipstick,RPA-LFD)快速鉴别大西洋鳕鱼制品真伪的方法。对比大西洋鳕鱼和常用来冒充鳕鱼的鱼类线粒体基因组序列,设计针对大西洋鳕鱼的特异性探针和引物,建立针对大西洋鳕鱼的RPA-LFD检测方法。该实验筛选最佳引物和探针并评估其特异性,优化反应温度、时间和现场检测条件,并对20份市售“大西洋鳕鱼”及常见的冒充鳕鱼的鱼类制品进行现场检测,评估检测效果。实验结果表明,RPA-LFD检测方法特异性强,在44℃、14 min条件下的检测效果最好。在现场开展快速检测,效果良好,20份鳕鱼制品检测结果经过基因测序证实和产品真实成分一致。该研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性强、反应耗时短、操作简便、结果可视,有良好的现场快速检测应用前景,为大西洋鳕鱼制品现场快速检测提供了新思路,为水产品市场监管提供了技术支持。 展开更多

关键词 大西洋鳕鱼 重组酶聚合酶扩增反应 真伪 侧流层析试纸条技术 现场快速检测

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基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

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作者 韩进刚 王菁 +3 位作者 徐赟霞 刘群 罗璋 冯守明 《河北渔业》 2022年第6期29-34,共6页

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法... 为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。 展开更多

关键词 鲤疱疹病毒2型(CyHV-2) 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析试剂条(lfd) 直接RPA法

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适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

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作者 姚梦丽 白昌明 +1 位作者 王崇明 辛鲁生 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2024年第4期166-174,共9页

为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流... 为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题,实现真正的现场快速检测,本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂,即核酸释放剂,适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20~100 mmol/L Tris-HCl、50~250 mmol/L KCl、0.01%~0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%~2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1~5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5~5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1~5 mg/mL明胶、0.01%~0.10%海藻糖、1%~5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化,采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂,100℃加热3 min,取上清液进行RPA-LFD反应,测试各组分不同浓度配比;并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示,核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂,适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备,有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤,极大地提高了核酸水平病原检测效率。 展开更多

关键词 核酸释放剂 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析试纸条(lfd) 虾肝胰腺 病原快速检测

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猫冠状病毒RPA-LFD快速检测方法的建立

5

作者 白雪瑞 李尚同 +5 位作者 战晓燕 王金福 钟登科 孙卫东 蒋蔚 滑志民 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期67-72,共6页

为快速精准检测猫冠状病毒(FCoV),用FCoV的7b基因设计引物与探针,构建重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)方法。通过筛选最佳反应时间与温度,测定其敏感性和特异性。结果显示,RPA-LFD方法在37℃、15 min条件下,最低检测限为1 pg/... 为快速精准检测猫冠状病毒(FCoV),用FCoV的7b基因设计引物与探针,构建重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)方法。通过筛选最佳反应时间与温度,测定其敏感性和特异性。结果显示,RPA-LFD方法在37℃、15 min条件下,最低检测限为1 pg/μL,比普通PCR灵敏1000倍。同时,该方法与猫杯状病毒、猫疱疹病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒均无交叉反应。通过9份临床病例的猫腹水样品检测,结果显示RPA-LFD与普通PCR结果一致。表明该方法快捷简便、特异性和灵敏性好,适用于快速检测FCoV感染。 展开更多

关键词 猫冠状病毒 重组酶聚合酶扩增 侧流层析试纸条

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侧流免疫层析技术在食品安全检测中的研究进展 被引量：7

6

作者 闫灵芝 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2022年第4期1-11,共11页

侧流免疫层析技术(lateral flow immunoassay,LFIA)不仅有效结合了层析技术的分离能力和免疫分析的高度特异性,而且操作简单、检测快速、价格低廉,为食品安全现场检测提供了一种理想的技术平台。常规的LFIA主要以纳米金颗粒作为信号标... 侧流免疫层析技术(lateral flow immunoassay,LFIA)不仅有效结合了层析技术的分离能力和免疫分析的高度特异性,而且操作简单、检测快速、价格低廉,为食品安全现场检测提供了一种理想的技术平台。常规的LFIA主要以纳米金颗粒作为信号标记材料,该种方法检测灵敏度相对较低,仅能满足定性和半定量检测。为了提高LFIA的检测性能,近年来研究者做了大量的努力。本文总结了LFIA的检测原理及其在在信号标记材料、信号增强方式、多元分析物同时检测、信号读出方式等方面的技术改进,并讨论了LFIA现有的不足以及未来的发展方向,以期为我国食品安全快速检测的发展提供技术参考。 展开更多

关键词 侧流免疫层析 试纸条 食品安全 快速检测技术

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葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系的建立

7

作者 黄强 张强强 顾沛雯 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第4期89-97,共9页

【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜... 【目的】建立葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification-lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测体系,为快速准确诊断和有效防治葡萄霜霉病提供参考。【方法】依据葡萄霜霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计了PF1/PR1、PF2/PR2和PF3/PR3共3对引物及探针RPA-P,对葡萄霜霉病菌DNA的ITS序列进行PCR扩增,建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,并对其反应条件进行优化,对其特异性和灵敏性进行检测。【结果】建立了葡萄霜霉病菌LFD-RPA检测体系,引物PF1/PR1和探针RPA-P对靶标片段具有良好的特异性,检测条件为36℃扩增30 min,对葡萄霜霉病菌具有特异性;最低检测下限为10 pg/μL,灵敏性略低于常规PCR(1 pg/μL)和荧光定量PCR(100 fg/μL);对田间发病叶片的检测结果与常规PCR一致,准确性高。【结论】建立的葡萄霜霉病菌重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测体系,可以对目标物质进行快速、可视化检测,具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,适宜推广使用。 展开更多

关键词 葡萄霜霉病 葡萄生单轴霉 重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测 病原检测

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RAA-CRISPR/cas13a(cpf1)-LFD兔出血症2型诊断方法的建立

8

作者 林芸 王媛 +3 位作者 刘立荣 陈佳祺 陈蓓蕾 王全溪 《福建农业学报》 北大核心 2025年第2期151-157,共7页

【目的】兔出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHdV-2)于2020年在我国被发现,并呈地方性流行。本研究旨在建立一种适用于生产一线的快速、简便且无需昂贵仪器的检测方法。【方法】采用生物信息学软件(Vector NTI alignment... 【目的】兔出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHdV-2)于2020年在我国被发现,并呈地方性流行。本研究旨在建立一种适用于生产一线的快速、简便且无需昂贵仪器的检测方法。【方法】采用生物信息学软件(Vector NTI alignment)分析兔出血症1型(rabbit hemorrhagic disease type 1, RHdV-1)和兔出血症2型RHdV-2基因组,筛选出RHdV-2特异且保守的VP60基因片段。基于此片段,设计重组酶介导等温核酸扩增技术-侧流层析试纸条检测(recombinase aided amplification-lateral flow dipstick, RAA-LFD)的探针与特异性引物。然后在RAA扩增产物的基础上,设计并筛选最适CRISPR衍生RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA),并对簇状规律间隔性成簇短回文重复序列相关蛋白13a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a, CRISPR-Cas13a)的反应体系进行优化。筛选针对RHdV-2的RAA-CRISPR/Cas13a (cpf1)-LFD诊断方法的最适反应时间,并对该方法的敏感性、特异性进行评价。最后使用该方法对临床31份疑似样品进行检测。【结果】同源性分析结果表明,RHdV-2的VP60基因上存在特异且保守的序列,合成VP60特异性引物进行RAA扩增。以RAA产物作为反应模板,发现crRNA1特异性最好。反应时间结果表明,在RAA基础反应后仅再需10 min即可在试纸条上出现明显阳性结果。敏感性试验结果显示,以重组质粒为模板,最低检出质粒拷贝数为6.7×10^(1) copies·μL^(-1)。特异性结果表明,只有RHdV-2为阳性,表明该方法特异性好。采用RAA-CRISPR/Cas13a(cpf1)-LFD法对31份临床样品进行检测,检出阳性样品10份,检出率为30.3%。【结论】本研究建立了一种针对RHdV-2的快速、简便的RAA-CRISPR/Cas13a (cpf1)-LFD检测方法,该方法对快速确诊RHdV-2以及科学防控该病具有十分重要的意义。 展开更多

关键词 重组酶介导的核酸等温扩增 CRISPR-Cas13a系统 侧流层析试纸条 兔出血症病毒2型 诊断方法

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K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及RPA-LFD快速检测方法的建立与应用

9

作者 喻华英 曾婷婷 +8 位作者 杨宗维 王粲 牙侯勋 万丽君 罗思思 李孟 谢芝勋 于美玲 谢丽基 《中国家禽》 北大核心 2025年第7期47-55,共9页

为满足基层实验室对K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)检测需求,研究建立了一种基于重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条(Recombinase polymerase amplifcation-lateral flow dipstick,RPA-LFD)的ALV-K快速检... 为满足基层实验室对K亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup K,ALV-K)检测需求,研究建立了一种基于重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条(Recombinase polymerase amplifcation-lateral flow dipstick,RPA-LFD)的ALV-K快速检测方法。试验首先通过细胞培养分离鉴定出一株ALV-K,并以此分离株的前病毒DNA作为建立检测方法的模板;其次,针对ALV-K gp85基因保守位置设计引物和探针,优化反应体系的引物浓度、探针浓度和反应温度,在此基础上进行敏感性预试验并以预试验检测限优化反应时间;最后,以优化反应时间进行敏感性试验、稳定性试验及特异性试验。结果显示:建立的ALV-K RPA-LFD反应体系在引物浓度为0.45 mmol/L,探针浓度为0.14 mmol/L,39℃条件下反应21 min,其检测限为4.86×10^(2) copies/反应的ALV-K DNA,并且不与其他常见禽类病原体核酸发生非特异扩增反应;30份临床病料中有14份ALV-K阳性,与单重PCR方法结果一致。研究表明,建立的ALV-K RPA-LFD检测方法具有快速、特异、操作简单,不需要复杂仪器,能够直观地观察结果的优点,适用于临床快速检测ALV-K,特别是实验室条件有限的检测场景。 展开更多

关键词 家禽 K亚群禽白血病病毒 重组酶聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条 快速检测

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基于RPA-LFD的鸭星状病毒2型核酸快速可视化检测技术

10

作者 何书海 晋丹丹 +4 位作者 薛玉坤 曲哲会 鲁绍芳 董建国 胡建新 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第12期46-51,共6页

为建立一种鸭星状病毒2型(DAstV-2)核酸的快速可视化检测方法,本试验基于重组酶聚合酶扩增结合横向侧流层析试纸条(RPA-LFD)技术,以DAstV-2的ORF2基因为检测靶标,设计和筛选适用于DAstV-2核酸检测的RPA引物和匹配探针,并优化反应条件;... 为建立一种鸭星状病毒2型(DAstV-2)核酸的快速可视化检测方法,本试验基于重组酶聚合酶扩增结合横向侧流层析试纸条(RPA-LFD)技术,以DAstV-2的ORF2基因为检测靶标,设计和筛选适用于DAstV-2核酸检测的RPA引物和匹配探针,并优化反应条件;进一步验证该方法的灵敏性、特异性和准确性。结果显示,筛选获得1对引物和匹配探针适用于DAstV-2核酸的RPA-LFD检测,探针的最佳工作浓度为5μmol/L;建立的RPA-LFD检测方法对DAstV-2核酸的最低检测限为3×10^(1)copies/μL;可特异性检测DAstV-2核酸,对鸭肝炎病毒(DHV)、鹅星状病毒(GAstV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鸭瘟病毒(DPV)的检测结果均为阴性;对疑似DAstV-2感染病鸭肝脏组织病毒核酸样本的检测结果显示,建立的RPA-LFD与实时荧光定量PCR检测结果的符合率为100%,且该检测方法更加便捷。本试验结果表明,利用RPA-LFD检测DAstV-2核酸灵敏度高、特异性强、准确性高,操作简单、检测快速,可在38℃恒温条件下15 min内实现DAstV-2核酸的快速可视化检测。 展开更多

关键词 鸭星状病毒2型 重组酶聚合酶扩增 横向侧流层析试纸条 快速检测 可视化

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动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立 被引量：4

11

作者 刘文俊 阳佑天 +5 位作者 易华东 邓汝森 杨培洁 付新亮 黄运茂 田允波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期474-478,共5页

为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,... 为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。 展开更多

关键词 重组酶聚合酶扩增 侧流层析试纸条 A型流感病毒

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RAA-LFD检测RHdV-2方法的建立 被引量：2

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作者 刘立荣 许高琳 +2 位作者 郑娱 游泽龙 王全溪 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期779-785,共7页

【目的】建立基于重组酶介导的核酸等温扩增(RAA)的侧流层析试纸条(LFD)方法,用于快速诊断兔出血症病毒(RHdV)2型(RHdV-2)。【方法】采用生物信息学软件分析RHdV-2、RHdV 1型(RHdV^(-1))基因组,筛选RHdV-2特异且保守的片段,设计RAA-LFD... 【目的】建立基于重组酶介导的核酸等温扩增(RAA)的侧流层析试纸条(LFD)方法,用于快速诊断兔出血症病毒(RHdV)2型(RHdV-2)。【方法】采用生物信息学软件分析RHdV-2、RHdV 1型(RHdV^(-1))基因组,筛选RHdV-2特异且保守的片段,设计RAA-LFD探针与特异性引物,以筛选最适引物及其浓度;对RAA-LFD检测的最适反应温度和时间进行优化,并对该方法的灵敏性、特异性、重复性进行评价及临床样品检测。【结果】同源性分析表明,RHdV-2的VP60基因存在特异且保守的序列。基于VP60基因设计3对引物,发现上游引物序列为5'-TCATTTGTACCCTTCAGCGGTACCACCATCC-3'、下游引物序列为5'-CCCGGCTGTTGTCTGGTTTATGCCATTT-3'的扩增效果最好,引物与探针混合液的最适浓度为5.000μmol·L^(-1)。用LFD-RAA方法检测RHdV-2的最适反应温度为39℃,最适反应时间为30 min。敏感性检测结果显示:以RHdV-2 VP60重组质粒为模板的最低检出量为6.7×103 ng·μL^(-1)。用建立的RAA-LFD方法对RHdV^(-1)的检测结果呈阴性,对RHdV-2的检测结果呈阳性,表明该方法的特异性良好。重复性检测结果显示,同一批次和不同批次试剂盒的检测结果均一致,表明重复性好。31份临床样品检测结果显示,5份为RHdV-2阳性样品。【结论】建立的检测RHdV-2的RAA-LFD方法具有简捷、易操作的特点,适合养殖场对RHdV-2的快速诊断。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 重组酶介导的核酸等温扩增 侧流层析试纸条 诊断方法

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布鲁氏菌RPA-LFD检测方法的建立 被引量：13

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作者 于博 李博宇 +6 位作者 赵博 李东 李健明 时坤 曾范利 宗颖 杜锐 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1233-1237,共5页

为建立一种快速,便于现场检测布鲁氏菌的方法,本研究基于布鲁氏菌(Brucella)Omp31基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件优化建立了布鲁氏菌重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,对该方法进行特异性、敏感性、... 为建立一种快速,便于现场检测布鲁氏菌的方法,本研究基于布鲁氏菌(Brucella)Omp31基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件优化建立了布鲁氏菌重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,对该方法进行特异性、敏感性、重复性检测。结果显示该检测方法在39℃反应20 min以上便可肉眼观察到明显结果。特异性试验结果显示除布鲁氏菌基因组呈阳性外,维氏气单胞菌、大肠杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型溶血性链球菌均为阴性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到101拷贝/μL的质粒标准品,比常规PCR高出100倍,敏感性较高;重复性试验结果显示,3次批间重复试验无明显差异,稳定性良好。利用该方法检测34份临床样品,其检测结果与普通PCR检测结果符合率为100%。本研究建立了一种快速检测布鲁氏菌的方法,该方法不需要特殊的仪器,操作简便,灵敏度高,肉眼即可观察到结果,为布鲁氏菌病的现场快速诊断提供了帮助。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 重组酶聚合酶扩增技术 侧流层析试纸条

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基于重组酶聚合酶等温扩增的间日疟快速可视化检测研究

14

作者 李诗慧 高春花 +5 位作者 危芙蓉 王多全 贾孝凯 张璟 王颖 石锋 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第4期413-418,共6页

目的基于重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)建立一种快速、可视化检测间日疟原虫的方法,并进行检测效果评价。方法以间日疟原虫18S rRNA基因保守序列(Ge... 目的基于重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术及侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)建立一种快速、可视化检测间日疟原虫的方法,并进行检测效果评价。方法以间日疟原虫18S rRNA基因保守序列(GenBank:DQ660817.1)为靶序列,利用Primer Premier 5设计引物和探针,以间日疟原虫标准质粒(pUCPv)为模板进行RPA和LFD检测,建立敏感、特异的间日疟原虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法。用RPA-LFD检测浓度为1×10^(3)、1×10^(2)、1×10^(1)、1×10^(0)、1×10^(-1) copies/μL的pUCPv,评价其灵敏度;用RPA-LFD检测恶性疟、三日疟、卵形疟、内脏利什曼病患者及健康参与者全血DNA,评价其特异性,并利用该方法检测24例确诊间日疟患者全血DNA样本,评价其敏感性。结果建立了敏感、特异、快速可视化检测间日疟核酸的RPA-LFD方法,该方法能够在39℃恒温条件下20 min内完成对间日疟原虫的检测,灵敏度可达1 copy/μL,与其他疟原虫、内脏利什曼原虫无任何明显交叉反应,特异性为100%。24例确诊间日疟患者的DNA样本检测阳性率为100%。结论建立的检测间日疟原虫核酸的快速可视化RPA-LFD方法敏感性高、特异性好、操作简便,且只需简易加热装置即可进行,适用于低资源环境下间日疟原虫的快速检测。 展开更多

关键词 间日疟原虫 重组酶聚合酶等温扩增 侧流层析试纸条 快速检测

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猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用 被引量：9

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作者 张森豪 王雪莹 +12 位作者 蔡李萌 解伟纯 匡虹迪 王晓娜 李佳璇 崔文 姜艳平 周晗 单智夫 王丽 乔薪瑗 李一经 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2498-2508,共11页

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶... 旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析(lfd) 快速诊断方法

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可视化RPA-LFD技术快速检测猪链球菌 被引量：12

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作者 张闪闪 何斌 +6 位作者 李书光 刘明成 姜金庆 胡建和 雷连成 沈志强 夏小静 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期538-547,共10页

旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,... 旨在建立一种可视化、操作简便的猪链球菌快速检测技术。针对猪链球菌种特异性基因谷氨酸脱氢酶(gdh)序列设计特异性引物,建立可同时检测出所有血清型的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测技术,优化反应温度与反应时间,评价其特异性与灵敏度,同时利用该法对45例疑似猪链球菌感染标本进行检测。结果显示:猪链球菌RPA-LFD法检测灵敏度可达100拷贝·μL^(-1),优于常规PCR方法,且不与其他常见病原菌发生交叉反应。扩增反应可在较宽温度范围(30~45℃)内高效进行,20~30 min可完成检测。利用临床45例疑似猪链球菌感染样本对检测体系进行评估,其检出率高于细菌分离与常规PCR方法,具有较强的实用性。本研究建立的猪链球菌RPA-LFD检测方法具有强特异性、高灵敏度、易于操作的特点,同时不依赖于仪器、专业操作人员,适用于野外及现场检测。 展开更多

关键词 猪链球菌 重组酶聚合酶等温扩增 侧流层析试纸条 快速检测

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金黄色葡萄球菌RAA-LFD快速检测方法的建立与应用 被引量：16

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作者 后来旺 李达容 +4 位作者 邓波 赵勇 潘迎捷 丰东升 孙晓红 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第4期331-339,共9页

靶向金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)保守基因(nuc)序列设计特异性引物,经引物筛选和反应条件的优化,建立金黄色葡萄球菌的重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)... 靶向金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)保守基因(nuc)序列设计特异性引物,经引物筛选和反应条件的优化,建立金黄色葡萄球菌的重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速检测方法。该方法在引物浓度200 nmol/L、33℃反应20 min即可实现靶标基因片段的有效扩增。特异性分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌与其他常见致病菌菌株间不存在交叉反应,灵敏度分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌的检出限为4 fg/μL(DNA)与1.83×10^(2) CFU/mL(纯菌液)。用人工污染牛奶样品验证RAA-LFD方法的可靠性,结果显示在增菌6 h时,RAA-LFD方法可检测到1.83×10^(1) CFU/mL金黄色葡萄球菌。分别采用微生物生化鉴定法、PCR法与RAA-LFD方法对64份牛奶样品进行金黄色葡萄球菌检测,结果表明,RAA-LFD方法与微生物生化鉴定法总符合率为95.3%,与PCR法总符合率(98.4%)表现出较高的一致性。本研究建立的可视化检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简单、检测结果直观、对仪器设备要求低等特点,为牛奶中金黄色葡萄球菌的检测提供新的发展方向。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 重组酶等温扩增技术 侧流层析试纸条 快速检测

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烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立 被引量：2

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作者 黎妍妍 邱梦娟 +7 位作者 李锡宏 张艺千 徐婷婷 许汝冰 马畔 郑露 李伦安 黄俊斌 《中国烟草科学》 CSCD 北大核心 2023年第5期62-69,共8页

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增... 烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害,近年来在我国部分省份发生严重,危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法,本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS),设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物RsRPA-F3/R3,建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃,15 min内特异性地检测到R.solani(1.40×10^(2) copies/µL)质粒DNA,与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中,准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点,为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。 展开更多

关键词 烟草靶斑病 立枯丝核菌 重组酶聚合酶扩增技术 侧流层析试纸条

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柑橘衰退病毒RT-RPA-LFD可视化检测方法的建立及应用 被引量：5

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作者 申世凯 曾婷 +3 位作者 乔兴华 陈力 任杰群 周彦 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期2652-2660,共9页

【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探... 【目的】柑橘衰退病由柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)引起,是一种世界性的重要柑橘病害。为实现CTV的田间快速检测,建立一种准确、快速且可视化的检测方法。【方法】以CTV外壳蛋白(CP)的保守区域为靶标,设计3对特异性引物和探针,通过引物筛选,以及优化引物浓度、反应时间和反应温度等条件,建立CTV的反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RT-RPA-LFD)快速检测方法,明确其灵敏度,并用于田间疑似样品的检测。【结果】建立了CTV的RT-RPA-LFD检测方法:最佳检测引物为RPA-1F/R,对应探针为RPA-P,最佳反应条件为40℃,25 min,且与其他5种柑橘病毒无交叉反应。该方法的灵敏度是RT-PCR的100倍,最低可检测到2.12×10^(1)拷贝·μL^(-1)的CTV核酸,与RT-qPCR相当。采用RT-RPA-LFD法在67份田间样品中检测出CTV阳性样品41份,与RT-PCR法检测结果一致。【结论】建立的CTV RT-RPA-LFD法具有操作简单、快速、结果可视等优点,适合基层植保工作者对田间样品开展快速检测。 展开更多

关键词 柑橘 柑橘衰退病毒 反转录-重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条 快速检测

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柑橘黄龙病RAA-LFD检测方法的建立 被引量：2

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作者 陈海云 滕丽琼 +1 位作者 邱英华 郑苏华 《现代农业科技》 2023年第1期61-66,共6页

本研究基于柑橘黄龙病菌50S核糖体亚基基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件的优化,建立了柑橘黄龙病菌RAA-LFD检测方法。该方法可快速高效地完成柑橘黄龙病菌检测,灵敏度可达到10 copies/μL;特异性试验结果显示,除柑橘... 本研究基于柑橘黄龙病菌50S核糖体亚基基因的保守片段设计并合成引物和探针,通过对反应条件的优化,建立了柑橘黄龙病菌RAA-LFD检测方法。该方法可快速高效地完成柑橘黄龙病菌检测,灵敏度可达到10 copies/μL;特异性试验结果显示,除柑橘黄龙病菌基因组呈阳性外,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、沙门氏菌均为阴性,特异性良好。利用该方法检测102份柑橘叶样本,结果显示,56份样本核酸为阳性,46份样本核酸为阴性;与荧光定量PCR法、RAA荧光法比较,RAA-LFD检测法弱阳的检出率偏低,但是RAA-LFD检测法摆脱了仪器依赖,操作更简便快速,无需电泳检测,避免了核酸扩增产物开盖污染的风险,适用于柑橘黄龙病菌的快速检测,适合在基层使用。 展开更多

关键词 柑橘黄龙病 等温扩增 侧流层析试纸条 快速检测

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