目的:建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法,为其基层检测的展开提供依据和便利。方法:利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flo...目的:建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法,为其基层检测的展开提供依据和便利。方法:利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD),辅以手持式胶体金读数仪;根据mcr-1基因保守序列设计合成一对特异性RPA引物,通过对反应条件和体系的优化,以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验,成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD方法。结果:在引物浓度400 nmol/L,引物比例1:1时,该方法最佳反应条件为Mg^(2+)浓度14.0 mmol/L,反应温度37℃,反应时间20 min;灵敏度好,标准曲线方程为y=0.117x+0.051,定量限为10^(1)~108 copies/μL,检出限为10^(1)copies/μL,比PCR法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR法一致。利用建立的RPA-LFD法对猪肉样品、鸡肉样品、生猪养殖场环境样品、肉鸡养殖场环境样品、大肠杆菌分离株和弯曲肠杆菌分离株各15份中多黏菌素耐药基因mcr-1携带情况进行分析;RPA-LFD法与常规PCR法阳性样本检出率一致,共检出9份mcr-1基因阳性样品。RPA-LFD定量分析显示,阳性样品中mcr-1基因浓度在4.5×10^(2)~8.6×10^(4)copies/μL之间。结论:本研究建立的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD检测法特异性强、灵敏性高、操作简单,可广泛应用于基层检验。展开更多
