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重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条技术快速可视化检测嗜麦芽窄食单胞菌方法的建立与应用 被引量：1
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作者 季拓 高玉芝 +1 位作者 王彦 高绪柱 《南京医科大学学报（自然科学版）》 北大核心 2024年第1期24-31,共8页
目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引... 目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法。方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物。通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对。根据最佳引物对,设计探针和修饰引物。在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系。根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件。使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性。以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度。收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价。结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果。该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强。应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致。与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性。结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌。该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力。 展开更多
关键词 嗜麦芽窄食单胞菌 重组酶聚合酶扩增 侧向流动试纸条
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重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流动试纸条快速检测锦鲤疱疹病毒 被引量：6
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作者 楚馨 冯梓钊 +3 位作者 姜有声 王浩 吕利群 许丹 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期866-873,共8页
为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增... 为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率。结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现。研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑。 展开更多
关键词 快速检测 重组酶聚合酶扩增技术 侧向流动试纸条 锦鲤疱疹病毒
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牛传染性鼻气管炎病毒ERA-LFD检测方法的建立与应用
3
作者 郭衍冰 侯绪森 +8 位作者 孙兴忠 王军富 王改丽 郝良玉 董航 王雪磊 刘杰 王楠 曹利利 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期79-85,共7页
为建立可视化检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的酶促恒温扩增-侧向流动试纸(ERA-LFD)方法,根据IBRV gB基因的保守区域设计并筛选最佳引物和探针,通过优化反应条件建立IBRV ERA-LFD方法,并对其特异性、敏感性、重复性和符合性进行评估。... 为建立可视化检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的酶促恒温扩增-侧向流动试纸(ERA-LFD)方法,根据IBRV gB基因的保守区域设计并筛选最佳引物和探针,通过优化反应条件建立IBRV ERA-LFD方法,并对其特异性、敏感性、重复性和符合性进行评估。结果显示,采用建立的方法检测牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、多杀性巴氏杆菌、弓形虫均无交叉反应,特异性强;建立方法最低检出IBRV阳性质粒的量为1.63×10^(1) copies/μL,比PCR方法高100倍,敏感性高;对相同样品进行批间和批内检测,结果均一致,重复性好;ERA-LFD与PCR方法检出的符合率为96%,且测序证实ERA-LFD检测结果无误。IBRV ERA-LFD的临床样本检测结果显示阳性率为2.08%,与PCR方法的结果相一致,说明IBRV ERA-LFD方法适于临床样品检测,为IBRV的临床快速检测和流行病学调查提供了工具。 展开更多
关键词 牛传染性鼻气管炎病毒 酶促恒温扩增 侧向流动试纸 检测方法
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基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法
4
作者 侯雨萌 赵振兴 +4 位作者 王思元 董铮 胡中泽 周涛 张永江 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第2期268-275,共8页
玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有... 玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)是一种重要的检疫性病毒,严重影响玉米的生产。为了有效防治玉米矮花叶病,本研究基于反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术和CRISPR/Cas12a系统构建了一种MDMV快速检测方法,将所有试剂集中在一个试管中进行反应,并通过侧向流动试纸条(LFD)检测反应结果。本研究筛选得到的最佳反应条件为,引物添加量2.8μL、FB报告分子浓度100 nmol/L、RT-RAA系统反应时间20 min、CRISPR/Cas12a系统反应时间20 min。本研究构建的基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的一管式玉米矮花叶病毒快速检测方法特异性强、灵敏度高,且所用试验材料方便携带和运输,适用于现场检测。 展开更多
关键词 玉米矮花叶病毒 反转录重组酶介导等温核酸扩增(RT-RAA)技术 CRISPR/Cas12a 侧向流动试纸条
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嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立 被引量：6
5
作者 王姝然 徐嘉楠 +4 位作者 范厚勇 郑跃平 周天琦 张也 许丹 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期849-858,共10页
文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和... 文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10^(3)cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。 展开更多
关键词 快速检测 重组酶聚合酶扩增技术 侧向流动试纸条 嗜水气单胞菌
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弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD快速检测方法的建立及应用 被引量：5
6
作者 王姝然 范厚勇 +3 位作者 徐嘉楠 周天琦 许丹 郑跃平 《大连海洋大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期241-249,共9页
为建立一种针对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)敏感性高、特异性强的临床快速检测方法,根据该菌定居因子基因cfa的保守序列,设计特异性引物,采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),并结合琼脂糖... 为建立一种针对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)敏感性高、特异性强的临床快速检测方法,根据该菌定居因子基因cfa的保守序列,设计特异性引物,采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),并结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)方法进行反应条件的优化及特异性与灵敏度的检测。结果表明:本研究中所建立的弗氏柠檬酸杆菌重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条(RPA-LFD)快速检测方法,在38℃条件下扩增20 min后,能特异性地检测到弗氏柠檬酸杆菌,对弗氏柠檬酸杆菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限分别为1.5×102 CFU/mL和200 fg/μL,是常规PCR(cfa引物)检测灵敏度(20 pg/μL)的100倍;利用所建立的RPA-LFD法与常规PCR同时检测杂交鲟攻毒试验样本,两种方法的检测结果一致。研究表明,本研究中建立的弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD方法,操作简便、反应迅速、特异性好、灵敏度高,并且不需要昂贵的仪器,该方法可为未来弗氏柠檬酸杆菌细菌性疾病的早期诊断提供更有效的技术支持。 展开更多
关键词 弗氏柠檬酸杆菌 快速检测 重组酶聚合酶扩增技术 侧向流动试纸条
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菜豆黄花叶病毒RPA-LFD技术快速检测方法的建立与应用 被引量：3
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作者 朱宇翔 秦嘉超 +3 位作者 季英华 陈新 陈学好 崔晓艳 《江苏农业科学》 北大核心 2023年第14期70-75,共6页
根据菜豆黄花叶病毒(bean yellow mosaic virus,简称BYMV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立蚕豆中BYMV的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,简称RPA)检测方法。同时,将该方法与侧向流动试纸条(L... 根据菜豆黄花叶病毒(bean yellow mosaic virus,简称BYMV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立蚕豆中BYMV的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,简称RPA)检测方法。同时,将该方法与侧向流动试纸条(LFD)检测方法相结合,建立RPA-LFD快速检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。结果表明,该方法可在37~42℃等温条件下进行,30 min即可完成检测。灵敏度试验表明,采用RPA-LFD方法检测BYMV的灵敏性是PCR方法的100倍。在特异性试验方面,与同属于马铃薯Y病毒属亲缘关系较近的大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,简称SMV)、菜豆普通花叶病毒(bean common mosaic virus,简称BCMV)和芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,简称TuMV)无交叉反应。因此,本研究建立的菜豆黄花叶病毒RPA-LFD技术检测快速、灵敏且高效,有望成为我国菜豆黄花叶病毒田间诊断与防控的实用性技术手段。 展开更多
关键词 菜豆黄花叶病毒 重组酶聚合酶扩增 侧向流动试纸条 病毒检测
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禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发 被引量：5
8
作者 华俊 曾婷婷 +7 位作者 谢芝勋 谢丽基 李孟 罗思思 王盛 万丽军 任红玉 谢志勤 《中国动物检疫》 CAS 2023年第4期99-105,共7页
禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡,引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求,建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法,使用侧向流动免疫试... 禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡,引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求,建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法,使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物,使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系,优化探针浓度和反应温度,使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验,最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示,建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10^(1)copies/反应的ARV RNA,并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料,发现有3份ARV阳性,与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的ARV RT-RPA-LFD检测方法,具有快速、特异,不需要大型复杂仪器,可直观观测结果的优势,为基层兽医实验室和兽医现场检测提供了技术参考。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 重组聚合酶核酸等温扩增技术 侧向流动免疫试纸条
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