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猪伪狂犬病病毒分离鉴定及gE和gC基因遗传进化分析
1
作者 武月 石兴亚 +4 位作者 张帅 赵云环 郭立明 左玉柱 范京惠 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期2266-2277,共12页
【目的】探究伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的变异情况及流行趋势,为PRV新型疫苗的研究提供数据参考。【方法】采集河北省保定市规模化养殖场经Bartha-K61疫苗免疫猪中疑似感染PRV的病料组织,通过PCR方式进行病原检测,将仅PRV阳性的组织滤液... 【目的】探究伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的变异情况及流行趋势,为PRV新型疫苗的研究提供数据参考。【方法】采集河北省保定市规模化养殖场经Bartha-K61疫苗免疫猪中疑似感染PRV的病料组织,通过PCR方式进行病原检测,将仅PRV阳性的组织滤液接种PK-15细胞进行病毒分离与纯化,通过间接免疫荧光试验和电镜观察对分离到的病毒进行鉴定,测定分离毒株的病毒滴度并绘制生长曲线,对分离毒株进行血清中和试验、动物致病性研究及gE、gC基因序列分析。【结果】分离株在PK-15细胞中产生典型的拉丝、圆缩、聚集和脱落等病变。纯化后的病毒传代培养至F10代,经PCR隔代检测均能扩增出大小约为742 bp的目的条带,将分离株命名为BD-HB-2024。间接免疫荧光试验鉴定可见绿色荧光标记的细胞;透射电镜下观察到病毒颗粒直径约为150 nm,呈圆球状,符合PRV典型粒子特征。依照Reed-Muench法测定该毒株的半数组织培养感染剂量(TCID_(50))为105.55/0.1 mL。血清中和试验发现,抗Bartha-K61株的血清对该分离株的中和抗体效价为1∶11.22,而抗变异株血清的中和抗体效价为1∶89.13。该毒株对小鼠有一定的致病性,F10代病毒对小鼠的半数致死量(LD_(50))为10-2.5 TCID_(50)/0.1 mL。通过与国内PRV变异毒株gE、gC基因序列比对发现,核苷酸序列相似性分别为99.8%~99.9%和99.8%~100%。遗传进化树分析表明,该分离毒株与经典毒株SC、Italy2014和Kaplan等相似性较低,亲缘关系较远;与国内近几年分离到的变异株HNB、HLJ8、JM和SX1911等相似性较高,亲缘关系较近且位于同一进化分支,比对氨基酸序列后发现符合国内变异株的典型变化。【结论】本试验证实了该养殖场存在PRV的感染,并成功分离到1株PRV变异毒株,该研究为后续新型疫苗的研发和免疫防控方案的制备提供了参考依据。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 变异株 分离鉴定 遗传进化
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伪狂犬病病毒冀A株TK基因的克隆及序列分析 被引量：4
2
作者 王琳 杨润德 +3 位作者 陈丽君 孙向华 苏晓健 程龙 《动物医学进展》 CSCD 2007年第4期29-33,共5页
为了分析比较伪狂犬病病毒(PRV)冀A株TK基因与GenBank中收录的国内外其他PRV毒株TK基因核苷酸及氨基酸序列的同源性,以伪狂犬病病毒冀A株的基因组为模板,PCR扩增了其胸腺激酶(TK)基因,并对其进行了克隆和测序。结果表明,TK基因的开放阅... 为了分析比较伪狂犬病病毒(PRV)冀A株TK基因与GenBank中收录的国内外其他PRV毒株TK基因核苷酸及氨基酸序列的同源性,以伪狂犬病病毒冀A株的基因组为模板,PCR扩增了其胸腺激酶(TK)基因,并对其进行了克隆和测序。结果表明,TK基因的开放阅读框(ORF)和所比较的各株的核苷酸和氨基酸同源性都在99%以上。核苷酸序列中发现在起始密码子的上游有3段GC框样的序列,在终止密码子中发现多聚腺苷加尾信号AATAAA;在氨基酸序列中发现有疱疹病毒TK基因的保守序列R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P*AR-。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒冀a毒株 TK基因 聚合酶链反应 核苷酸序列 氨基酸序列
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天津地区猪伪狂犬病毒变异株的分离鉴定及主要相关毒力基因分析 被引量：3
3
作者 程宁 杨程 +7 位作者 李欣蕾 孙久英 王凯月 韩俊平 李文军 王欢欢 邵笑 孙英峰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期902-908,共7页
为了鉴定猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株及其携带毒力基因的变异情况,本研究采集1份天津地区某猪场免疫过Bartha-K61疫苗但患严重神经症状的仔猪脑组织样品,采用荧光定量PCR(q PCR)检测PRV g E基因,并将检测为PRV的阳性样品接种PK-15细胞分... 为了鉴定猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株及其携带毒力基因的变异情况,本研究采集1份天津地区某猪场免疫过Bartha-K61疫苗但患严重神经症状的仔猪脑组织样品,采用荧光定量PCR(q PCR)检测PRV g E基因,并将检测为PRV的阳性样品接种PK-15细胞分离培养,并传3代后采用Reed-Muench法测定分离病毒的TCID_(50),采用q PCR和间接免疫荧光试验(IFA)进一步鉴定分离病毒。结果显示,经q PCR检测仔猪脑组织样品出现扩增曲线,阳性样品分离培养后测得病毒滴度为10^(7.57)TCID_(50)/m L,分离病毒的q PCR结果出现扩增曲线,且其感染的细胞出现绿色荧光。表明分离到一株PRV,命名为TJbd2023株。采用PCR分别扩增TJbd2023株主要相关毒力基因g B、g C、g D、g E、g G、g I和TK,采用Meg Align软件分析分离病毒与Gen Bank登录的PRV参考株上述各毒力相关基因序列的同源性,通过Neighbor-Joining(NJ)法构建上述各毒力相关基因的进化树,采用Meg Align软件分析各毒力基因编码氨基酸主要位点的变异情况。结果显示,分别扩增到TJbd2023株的各相应毒力基因;各毒力基因的同源性分析结果显示,TJbd2023株与国内2012年后流行变异株的相似性高达98.4%~100.0%,与疫苗株(Bartha-K61)的相似性为89.6%~93.2%。进化树结果显示,这7个毒力基因均与国内GD0304株(MH582511)、BJYT株(KC981239)和DL1408株(KU360259)等PRV变异株位于同一分支,与疫苗株(Bartha-K61)未在同一分支。g B、g C、g E氨基酸序列除出现PRV变异株相同的突变位点外,g B还出现R^(223)H和E^(836)K的突变、g D出现R^(320)S和g E出现T^(242)A的突变。将TJbd2023株分别以5个剂量(10^(2.57)TCID_(50)/m L~10^(6.57)TCID_(50)/m L)感染6周龄KM小鼠,通过小鼠的临床症状、死亡率、死亡小鼠各组织的病理变化评估该病毒的致病性。结果显示,在5 d的观察期内,感染组小鼠陆续出现奇痒及神经症状,各实验组小鼠的死亡率分别为60%、80%、100%及100%,对照组小鼠均健活。死亡小鼠各组织病变观察可见肺组织浸润性出血、肝组织血管充血及淋巴细胞增多、脑胶质细胞增多及血管周围炎性细胞聚集形成血管套等病变,对照组小鼠各组织均无明显病变。上述结果表明,本研究在天津地区分离到一株PRV变异株,其毒力因子发生了独特的氨基酸位点突变,对小鼠的致病性较强,该结果丰富了PRV的致病性及其毒力因子变异的特征,为PR的综合防控提供参考。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 变异株 分离鉴定 遗传进化分析 致病性
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伪狂犬病病毒荧光标签毒株构建及其在抗病毒药物筛选中的初步应用
4
作者 呙会会 张浩 +5 位作者 杨丹 旷燕 李亚菲 刘绍蒙 刘青芸 王湘如 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3600-3611,共12页
为筛选针对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的有效抗病毒药物,本研究以PRV人源分离毒株hSD-1/2019和经典猪源流行毒株Ea为亲本病毒,采用同源重组技术将mCherry报告基因插入到PRV的UL 35基因终止子之前位点,构建了表达红色荧光蛋白... 为筛选针对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的有效抗病毒药物,本研究以PRV人源分离毒株hSD-1/2019和经典猪源流行毒株Ea为亲本病毒,采用同源重组技术将mCherry报告基因插入到PRV的UL 35基因终止子之前位点,构建了表达红色荧光蛋白mCherry的荧光标签毒株PRV-mCherry。基于构建的荧光标签病毒,以荧光强度为指标,建立高通量药物筛选平台,对天然产物库中1621种化合物进行抗病毒药物筛选,并初步探索药物特性。结果表明,mCherry标签插入位置正确且稳定遗传,荧光标签毒株PRV-mCherry与亲本毒株在PK-15细胞上的增殖曲线趋势一致,且荧光强度可反映病毒增殖情况。使用PRV-mCherry从天然产物库中成功筛选出3种可在体外有效抑制PRV增殖的药物,根据测定的50%细胞毒性浓度和50%抑制浓度,计算出3种药物的选择指数范围为203.63~564.58μmol·L^(-1),表明其具有良好的成药性。本研究为临床防治PRV感染的抗病毒药物发掘提供了新的策略和思路。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 人源分离株 荧光标签毒株 抗病毒药物
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猪伪狂犬病病毒BJC变异株分离鉴定及gB和gE基因序列分析
5
作者 娄昆鹏 李阳 +2 位作者 项伟 徐博 朱国强 《动物医学进展》 北大核心 2024年第9期20-26,共7页
为了确定伪狂犬病疑似发病猪场PRV变异株病原及其病毒分子特征,通过病理剖检、病毒分离鉴定与纯化、ST细胞TCID_(50)和小鼠LD_(50)测定,对分离鉴定的病毒gB、gE基因进行PCR扩增、回收、克隆和测序,用生物信息学分析软件Geneious Prime... 为了确定伪狂犬病疑似发病猪场PRV变异株病原及其病毒分子特征,通过病理剖检、病毒分离鉴定与纯化、ST细胞TCID_(50)和小鼠LD_(50)测定,对分离鉴定的病毒gB、gE基因进行PCR扩增、回收、克隆和测序,用生物信息学分析软件Geneious Prime对gB、gE基因进行遗传进化和同源性分析。结果显示,该分离株为PRV强毒株。该病毒在ST细胞生长良好,纯化后的病毒经测定半数组织培养感染量为10^(8.5)TCID_(50)/mL,对6周龄昆明小鼠的LD_(50)为10^(5.8)TCID_(50)。测序结果与预期的PRV gB、gE基因片段相符。遗传进化分析可知与国内代表PRV变异毒株如JS2012、HN1201、ZJ01等处于同一分支,与欧美分离株如Bartha、Kaplan、Becker等亲缘关系较远,处于不同的大分支。氨基酸序列分析表明,BJC株与国外经典毒株和国内早期分离毒株存在多个特征性位点替换,符合国内流行变异毒株特征,BJC株为PRV变异毒株。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒病 分离鉴定 BJC株 gB、gE基因 序列分析
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猪伪狂犬病病毒变异株传代致弱JS18-150株的获得与鉴定
6
作者 侯真真 张华伟 +5 位作者 郝根喜 罗修鑫 宋文博 周明光 陈焕春 徐高原 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期178-185,共8页
为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代,最终获得JS18-150株,随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安... 为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代,最终获得JS18-150株,随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安全性和免疫原性进行初步研究。试验结果显示,在CEF上连续传代后,JS18株的gI、gE、US9基因缺失,获得的JS18-150株毒力已致弱,在CEF上适应性显著提高,与JS18株生长动力学相似;将JS18-150株以107.0TCID50/mL接种仔猪,所有仔猪均未观察到任何临床症状,且体温均未超过40.5℃;JS18-150株以106TCID50/mL接种仔猪后能保护仔猪有效抵御JS18株和HBZL05株的攻击。结果表明,JS18-150株对仔猪安全性良好,可作为PRV弱毒疫苗研制的候选毒株。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 变异株 传代致弱 基因缺失 伪狂犬病疫苗
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猪伪狂犬病病毒变异毒株与经典毒株实时荧光定量PCR鉴别诊断方法的建立和应用
7
作者 李媛 张盼 +2 位作者 唐慧芬 候凤 师小潇 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第12期58-63,共6页
为了建立猪伪狂犬病病毒(PRV)变异毒株与经典毒株的快速鉴别诊断方法,本试验根据PRV变异毒株与经典毒株的糖蛋白gC基因设计鉴别引物和探针,加入纳米金优化建立实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法,验证其敏感性、特异性和重复性... 为了建立猪伪狂犬病病毒(PRV)变异毒株与经典毒株的快速鉴别诊断方法,本试验根据PRV变异毒株与经典毒株的糖蛋白gC基因设计鉴别引物和探针,加入纳米金优化建立实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法,验证其敏感性、特异性和重复性。利用建立的qPCR和测序分析方法同时对新疆4个不同地区采集的猪场临床样品进行检测和分析。优化后的qPCR检测结果显示,重组阳性质粒PUC57-Var标准品在1×10^(9)~1×10^(3)copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999,斜率为-3.325,最低检测限为1×10^(3)copies/μL,与其他猪源常见病毒未发生交叉反应,组内和组间重复性试验的变异系数均小于3%;该qPCR方法对临床样品的检测结果与测序分析结果一致。结果表明,本试验建立的qPCR方法可用于PRV变异毒株与经典毒株的鉴别诊断,为PRV的准确诊断和疫苗应用提供科学依据。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒(PRV) 变异毒株 实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)
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鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
8
作者 李倩倩 黄英 +7 位作者 陈翔鸿 宋文博 杨柳 龙云志 余道兵 梁巩 黄超 汤细彪 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期68-74,共7页
为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性... 为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒(PRV) gI/gE基因部分缺失疫苗株 鉴别诊断 TaqMan实时荧光定量PCR
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安徽省桐城市散养户猪群感染伪狂犬病野毒的血清学调查
9
作者 吴程华 《上海畜牧兽医通讯》 2025年第4期35-37,共3页
为评估安徽桐城市散养户猪群感染伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株情况,于2023年9月—2024年9月,选取该市10个行政村/社区的10户散养户进行猪血清采样,并使用猪伪狂犬gE鉴别ELISA诊断试剂盒检测PRV gE抗体。结果显示:10个行... 为评估安徽桐城市散养户猪群感染伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株情况,于2023年9月—2024年9月,选取该市10个行政村/社区的10户散养户进行猪血清采样,并使用猪伪狂犬gE鉴别ELISA诊断试剂盒检测PRV gE抗体。结果显示:10个行政村/社区的总体阳性率为6.99%(10/143),其中杨树村阳性率最高(11.1%),水岭村等4个村阳性率为0;长白猪阳性率为7.55%,略高于约克猪(6.67%);公猪阳性率为8.89%,高于母猪(6.12%);6~8月龄猪阳性率为7.53%,高于9~10月龄和大于10月龄猪只。结果表明,桐城市散养户猪群PRV野毒株感染呈低流行态势,但存在地域差异,需有针对性地强化防控措施。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病 野毒株 gE抗体 散养户 血清学调查 桐城
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伪狂犬病病毒Guizhou-DY株的分离鉴定及致病性研究 被引量：37
10
作者 郝飞 汤德元 +5 位作者 李春燕 曾智勇 罗险峰 甘振磊 刘建 王洪光 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1851-1856,共6页
通过采集疑似猪伪狂犬病流产胎儿病料，采用细胞接毒分离培养、病毒蚀斑纯化、病毒的形态结构观察、易感动物接种试验和病毒核酸鉴定分离到1株伪狂犬病病毒（PRV），命名为PRVGuizhou—DY株（GenBank登录号为JX417716）；为了摸清其理... 通过采集疑似猪伪狂犬病流产胎儿病料，采用细胞接毒分离培养、病毒蚀斑纯化、病毒的形态结构观察、易感动物接种试验和病毒核酸鉴定分离到1株伪狂犬病病毒（PRV），命名为PRVGuizhou—DY株（GenBank登录号为JX417716）；为了摸清其理化特性，进一步对Guizhou—DY分离株进行了耐热、耐酸及脂溶性敏感性试验、核酸类型鉴定及病毒毒价测定，同时进行病毒致病性试验。分离鉴定结果表明：病料接种Vero细胞盲传至第2代时产生明显CPE，盲传至第4代可出现稳定的CPE；病毒粒子在电镜下呈椭圆形、有囊膜、直径为120～180nm，核内可见呈晶格状排列的病毒包涵体；病毒悬液接种家兔能引起家兔奇痒、麻痹死亡；理化特性研究表明：该病毒是一种耐热不耐酸且对氯仿敏感的DNA病毒，gE全基因序列与PRVGZ—Z1株、Fa株及Ea株的相似性分别为97．60A、98．9％和99．4％，其TCID50为10-9.71·100μL-1，PFu为109·mL-1. 攻毒组猪体温升高，临床症状较为明显，在攻毒后第5天开始出现中和抗体，第21天达到最高。该研究可为PRV病原学研究提供参考。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 Guizhou—DY株 分离鉴定 致病性
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猪伪狂犬病病毒新流行变异毒株的研究进展 被引量：44
11
作者 华利忠 刘剑锋 +2 位作者 冯志新 杨若松 邵国青 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期-,共5页
近30年内,猪伪狂犬活疫苗的应用对中国猪伪狂犬病的防控贡献巨大。2011年以来,中国许多免疫猪场相继暴发猪伪狂犬疫情,给养猪业造成了巨大的损失。研究显示最新流行的PRV毒株为变异株,部分商品化活疫苗不能对其提供完全的保护。本文详... 近30年内,猪伪狂犬活疫苗的应用对中国猪伪狂犬病的防控贡献巨大。2011年以来,中国许多免疫猪场相继暴发猪伪狂犬疫情,给养猪业造成了巨大的损失。研究显示最新流行的PRV毒株为变异株,部分商品化活疫苗不能对其提供完全的保护。本文详细介绍了2011年以来中国猪伪狂犬病的发病情况及其分子流行病学调查结果,分析了猪伪狂犬新变异株的分子生物学特性及其变异株来源,同时论述了针对PRV突变株新型疫苗的研究进展,最后对深入开展中国猪伪狂犬病控制与净化研究进行了展望。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 变异株 分子生物学 疫苗
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伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析 被引量：8
12
作者 洪文洲 陈焕春 +3 位作者 方六荣 周锐 何启盖 吴斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期235-243,共9页
本研究从含有伪狂犬病病毒 (Pseudorabiesvirus,PRV)Ea株 gD基因BamHI 6 6Kb片段的重组质粒 pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段 ,并对上游片段进一步改造 ,去掉 gD基因上游的非编码序列 ,构建了含完整 gD基因编码区的重组质粒 pBR... 本研究从含有伪狂犬病病毒 (Pseudorabiesvirus,PRV)Ea株 gD基因BamHI 6 6Kb片段的重组质粒 pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段 ,并对上游片段进一步改造 ,去掉 gD基因上游的非编码序列 ,构建了含完整 gD基因编码区的重组质粒 pBRgDI,并利用基因内部的限制性内切酶位点 ,用内切酶KpnI和SalI酶切分析 ,证实了 gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒 pSKgDSB和 pSKgDS ,并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较 ,发现Ea株 gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变 ,在编码氨基酸残基水平上也有差异。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 Ea株 GD基因 克隆 序列分析 伪狂犬病
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伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析 被引量：11
13
作者 王勤 郭万柱 +2 位作者 徐志文 汪铭书 王小玉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期389-393,共5页
根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRVFa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1 7kb的特异片段,经酶切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经KpnⅠ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到... 根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRVFa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1 7kb的特异片段,经酶切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经KpnⅠ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到了明显大于载体的重组质粒PpgE。重组质粒PpgE经酶切鉴定为含有PRV的gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。5毒株的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这体现了gE基因的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示Fa、Ea、SH可能是同一毒株。gE序列在1040-1410碱基的高同源性区域作为PRV的PCR检测或作为核酸探针是非常重要的。 展开更多
关键词 猪 伪狂犬病 病毒 Fa株 GE基因 克隆 序列分析 PCR扩增
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伪狂犬病病毒鄂A株gG^-/LacZ^+突变株的构建 被引量：11
14
作者 周复春 陈焕春 +3 位作者 方六荣 周锐 吴斌 何启盖 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期134-138,共5页
以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本 ,提取其基因组DNA ,克隆含 gG基因的SphⅠ /KpnⅠ片段 ,然后将LacZ基因融合到 gG启动子下游 ,得到重组质粒 pUSKZ ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK 15细胞 ,待细胞完全病变后 ,在X gal存在下 ,... 以从湖北某猪场分离鉴定的鄂A株为亲本 ,提取其基因组DNA ,克隆含 gG基因的SphⅠ /KpnⅠ片段 ,然后将LacZ基因融合到 gG启动子下游 ,得到重组质粒 pUSKZ ,将重组质粒与鄂A株基因组共转染PK 15细胞 ,待细胞完全病变后 ,在X gal存在下 ,作蓝斑筛选纯化。经斑点杂交和PCR扩增证实得到的是基因型为 gG- /LacZ+ 的重组伪狂犬病病毒。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 鄂A株 突变株
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伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/gE^-/gI^-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究 被引量：17
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作者 刘正飞 陈焕春 +2 位作者 吴斌 何启盖 秦永辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期70-73,共4页
对PrVEaTK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明,该基因缺失疫苗105 0TCID50和106 0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的,并可保护妊娠母猪抵抗107 1TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d... 对PrVEaTK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力进行了系统的研究。试验表明,该基因缺失疫苗105 0TCID50和106 0TCID50病毒剂量对妊娠母猪、新生仔猪和育肥猪均是安全的,并可保护妊娠母猪抵抗107 1TCID50强毒的攻击。新生仔猪免疫30d后,gE鉴别ELISA试验表明,PrVEaTK-/gE-/gI-免疫猪不产生针对gE的抗体。育肥猪在二次免疫后中和抗体水平显著升高。以105 0TCID50和106 0TCID50疫苗病毒接种家兔、猫和奶山羊等非靶动物,结果非靶动物未出现精神异常或死亡现象,说明该基因缺失疫苗具有极高的生物安全性。 展开更多
关键词 伪狂犬病 病毒 鄂A株 TK^-/gE^-/gI^-基因 基因缺失 疫苗 安全性 保护力
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致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定 被引量：9
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作者 张超范 刘长明 +1 位作者 危艳武 刘霓虹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期212-215,共4页
从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系(PK-15)分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,... 从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系(PK-15)分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第24代毒价达108.5 TCID50/mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110 nm～150 nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150 nm～180 nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因,其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7%～100%。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24 h～72 h内全部死亡。研究表明,PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 强毒株 分离 鉴定
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伪狂犬病毒UL14基因缺失突变株的构建及其生物学特性研究 被引量：10
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作者 张辉 方六荣 +4 位作者 赵骞 薛念波 江云波 肖少波 陈焕春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期369-375,共7页
UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV-Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的U... UL14在α-疱疹病毒中相当保守,但其在伪狂犬病毒中的功能尚不清楚。本研究以伪狂犬病毒鄂A株(PRV-Ea)为亲本株,通过同源重组,将编码EGFP的真核表达盒插入到伪狂犬病毒基因组的UL14基因中,PCR检测和荧光观察证实获得了能稳定表达EGFP的UL14插入失活突变株PRV-UL14D。将PRV-UL14D感染IBRS-2细胞,发现该突变株较PRV-Ea野毒株增殖缓慢,而且PRV-UL14D突变株感染细胞后形成的蚀斑也明显小于PRV-Ea野毒株,但在稳定表达UL14的IBRS-2细胞系中,PRV-UL14D与PRV-Ea野毒株的增殖速度、形成的蚀斑大小均无明显差异。进一步将PRV-UL14D感染BALB/c小鼠,发现与相同剂量的PRV-Ea野毒株感染相比,小鼠平均死亡时间明显延缓。上述研究结果表明,UL14并非伪狂犬病毒增殖必需的,但其缺失可延缓病毒增殖,推测UL14可能与病毒粒子在细胞间的扩散有关。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒 UL14 突变株 生物学特性
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猪伪狂犬病毒Jiangxi-FZ株的分离鉴定及其重要毒力基因分子特征 被引量：10
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作者 范克伟 戴爱玲 +3 位作者 吴德峰 林炜明 卢马英 杨小燕 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1103-1110,共8页
目的研究伪狂犬病病毒(PRV)新流行毒株重要毒力基因的分子特征。方法本研究从江西省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过PCR鉴定、病毒分离培养、细胞免疫荧光及易感动物试验证实该病毒为PRV野毒株并命名为... 目的研究伪狂犬病病毒(PRV)新流行毒株重要毒力基因的分子特征。方法本研究从江西省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过PCR鉴定、病毒分离培养、细胞免疫荧光及易感动物试验证实该病毒为PRV野毒株并命名为PRV Jiangxi-FZ株。并对其重要毒力基因TK、gB、gC、gD及gE的分子特征和遗传进化关系进行分析。结果 Jiangxi-FZ株与其他PRV参考毒株的TK、gB、gC、gD及gE基因在核苷酸和氨基酸水平均具有很高的保守性,尤其是与2012年分离的2株PRV变异株的同源性较高。但在高度保守的基础上,仍存在一些差异,且部分差异具有特征性。遗传进化树分析结果显示,PRV Jiangxi-FZ株与2012年国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近,而与Becker等欧美洲毒株亲缘关系相对较远。结论 Jiangxi-FZ株具有当前PRV流行毒株的代表性,属近年来流行的PRV变异毒株。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 分离鉴定 毒力基因 分子特征
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伪狂犬病病毒Ea株UL54基因的克隆与序列分析 被引量：9
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作者 方六荣 陈焕春 +2 位作者 肖少波 徐引娣 何启盖 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期103-106,共4页
根据伪狂犬病病毒国外Ka株UL5 4基因核苷酸序列 ,设计一对包含UL5 4基因完整编码区的引物 ,以伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.1kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到pBluescriptⅡsk +中 ,酶切分析... 根据伪狂犬病病毒国外Ka株UL5 4基因核苷酸序列 ,设计一对包含UL5 4基因完整编码区的引物 ,以伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.1kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到pBluescriptⅡsk +中 ,酶切分析证实后经双脱氧末端终止法进行全序列测定 ,序列分析结果表明Ea株UL5 4基因全长 10 86bp ,可编码 36 1个氨基酸。由二级结构预测数据推断C 末端具有典型的锌指结构域。运用Blast软件与Ka株UL5 4基因进行同源比较 ,发现Ea株UL5 4基因在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处点突变 ,但无插入或缺失突变 ;将Ea株UL5 4氨基酸序列同其它 4种α 疱疹病毒 (HSV 1、HSV 2、VZV、EHV 1)进行同源比较 ,同源性分别为 47%、36 %、36 %和 44 %。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 Ea株 UL54基因 克隆 序列分析
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伪狂犬病病毒鄂A株TK^-/LacZ^+突变株的构建 被引量：9
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作者 方六荣 周复春 +2 位作者 陈焕春 吴斌 何启盖 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期244-248,共5页
本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针 ,通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约 5 9kb的KpnI片段中含有TK基因 ,回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段 ,并将... 本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针 ,通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约 5 9kb的KpnI片段中含有TK基因 ,回收该片段并克隆于pUC18的KpnI位点。然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段 ,并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHI位点 ,构建转移质粒 pUEKPZ。将该质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK 15细胞 ,待完全病变后在X gal存在下筛选蓝斑 ,蓝斑纯化 3次后 ,经PCR扩增、Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK- /LacZ+ 突变株。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 鄂A株 TK-/LacZ突变株 基因缺失标志疫苗株
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