目的:探讨敲低小鼠胚胎腭突间充质细胞(mEPMCs)初级纤毛(PC)重要组件驱动蛋白家族成员3B(KIF3B)基因对细胞自噬水平的作用,并阐明其作用机制。方法:收集体外培养孕龄14.5 d C57BL/6J小鼠的mEPMCs,根据是否敲低KIF3B基因和使用平滑因子...目的:探讨敲低小鼠胚胎腭突间充质细胞(mEPMCs)初级纤毛(PC)重要组件驱动蛋白家族成员3B(KIF3B)基因对细胞自噬水平的作用,并阐明其作用机制。方法:收集体外培养孕龄14.5 d C57BL/6J小鼠的mEPMCs,根据是否敲低KIF3B基因和使用平滑因子受体激动剂(SAG)激活音猬因子(Shh)信号通路及其下游共受体Smo,分为对照组(给予生理盐水)、空载病毒转染细胞组(sh-NC组)(给予慢病毒转染)、敲低KIF3B组(sh-KIF3B组)(给予KIF3B基因敲低)、敲低KIF3B加入SAG组(sh-KIF3B+SAG组)(给予KIF3B基因敲低后加入SAG),每组5只大鼠。透射电镜观察各组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体形态表现及数量,Western blotting法检测各组mEPMCs中自噬相关蛋白苄氯素1(Beclin-1)和p62及Shh信号通路中Shh和Smo蛋白表达水平。结果:透射电镜观察,与对照组比较,sh-KIF3B组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显增加(P<0.05);与sh-KIF3B组比较,sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显减少(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,sh-KIF3B组mEPMCs中Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),KIF3B、p62、Shh和Smo蛋白表达水平均明显降低(P<0.01);与sh-KIF3B组比较,sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中Shh、Smo和p62蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Beclin-1蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:敲低KIF3B基因可促进mEPMCs自噬,其机制可能与其抑制Shh信号通路有关。展开更多
文摘目的:观察人胃癌、癌旁组织与胃癌AGS细胞中人音猬因子相互作用蛋白(human hedgehog interacting protein,HHIP)基因启动子区域CpG岛的甲基化水平,探索其与胃癌发生的关系。方法:RT-PCR检测30例人胃癌组织、癌旁组织及AGS细胞中HHIP mRNA的表达,免疫组织化学方法和甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)分别检测胃癌组织和癌旁组织的HHIP表达和HHIP基因启动子区域甲基化状态。AGS细胞予甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycitydine,5-Aza-dc)处理前后,RT-PCR、MSP和硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)分别检测AGS细胞中HHIP mRNA表达、启动子区域甲基化水平变化、CpG岛甲基化位点数量的变化;分析HHIP基因启动子区CpG岛甲基化水平变化与HHIP mRNA表达水平变化之间的相关性。结果:胃癌组织中的HHIP mRNA(0.82±0.38 vs 1.60±0.26,P=0.000)和蛋白(0.51±0.03 vs 0.83±0.27,P<0.05)的表达均低于癌旁组织,并且与年龄、性别、TNM分期、分化程度、淋巴结转移均无显著相关性(均P>0.05)。癌旁组织中HHIP基因启动子区甲基化水平显著低于胃癌和AGS细胞[(17.7±3.59)%vs(62.9±6.14)%、(99.7±0.67)%,均P<0.05]。AGS细胞在5-Aza-dc干预后HHIP mRNA表达明显增高(4.68±0.22 vs 0.21±0.12,P<0.01),HHIP基因启动子区甲基化水平明显下降[(10.1±0.21)%vs(90.2±0.67)%,P<0.01],CpG岛甲基化位点明显减少,并且HHIP基因启动子区甲基化水平与mRNA表达呈负相关(r=-0.693,P=0.00)。结论:HHIP基因启动子区CpG岛的高甲基化水平可能通过抑制HHIP基因表达参与胃癌的发生。
文摘目的:探讨敲低小鼠胚胎腭突间充质细胞(mEPMCs)初级纤毛(PC)重要组件驱动蛋白家族成员3B(KIF3B)基因对细胞自噬水平的作用,并阐明其作用机制。方法:收集体外培养孕龄14.5 d C57BL/6J小鼠的mEPMCs,根据是否敲低KIF3B基因和使用平滑因子受体激动剂(SAG)激活音猬因子(Shh)信号通路及其下游共受体Smo,分为对照组(给予生理盐水)、空载病毒转染细胞组(sh-NC组)(给予慢病毒转染)、敲低KIF3B组(sh-KIF3B组)(给予KIF3B基因敲低)、敲低KIF3B加入SAG组(sh-KIF3B+SAG组)(给予KIF3B基因敲低后加入SAG),每组5只大鼠。透射电镜观察各组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体形态表现及数量,Western blotting法检测各组mEPMCs中自噬相关蛋白苄氯素1(Beclin-1)和p62及Shh信号通路中Shh和Smo蛋白表达水平。结果:透射电镜观察,与对照组比较,sh-KIF3B组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显增加(P<0.05);与sh-KIF3B组比较,sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中自噬小体/自噬溶酶体数量明显减少(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,sh-KIF3B组mEPMCs中Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),KIF3B、p62、Shh和Smo蛋白表达水平均明显降低(P<0.01);与sh-KIF3B组比较,sh-KIF3B+SAG组mEPMCs中Shh、Smo和p62蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Beclin-1蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:敲低KIF3B基因可促进mEPMCs自噬,其机制可能与其抑制Shh信号通路有关。
