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重组人角质细胞生长因子-2基因克隆、表达、纯化与活性分析 被引量:13
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作者 马雁冰 李擎 +4 位作者 谢天宏 李鸿钧 冮宏映 戴长柏 孙茂盛 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期761-765,共5页
从人胚肺二倍体细胞KMB17中抽提总RNA ,经RT PCR扩增获得编码人角质细胞生长因子 2 (keratinocytegrowthfactor 2 ,KGF 2 )的cDNA .克隆于硫氧环蛋白表达载体pThioHisA ,序列分析表明与文献报道一致 .经IPTG诱导 ,在大肠杆菌BL2 1中实... 从人胚肺二倍体细胞KMB17中抽提总RNA ,经RT PCR扩增获得编码人角质细胞生长因子 2 (keratinocytegrowthfactor 2 ,KGF 2 )的cDNA .克隆于硫氧环蛋白表达载体pThioHisA ,序列分析表明与文献报道一致 .经IPTG诱导 ,在大肠杆菌BL2 1中实现高效表达 ,表达量可达菌体总蛋白 10 %~15 % .菌体超声破碎 ,上清经CM SepharoseFF阳离子交换 ,Heparin Sepharose亲和层析 ,Superdex 75凝胶过滤层析纯化得到重组人KGF 2 ,纯度高于 95 % .生物活性分析表明 ,它能够促进成纤维细胞NIH 3T3的增殖 ,诱导鸡胚背根神经结神经轴突的生长 ,促进鸡胚尿囊膜血管生成 .研究结果表明 ,获得了 95 %纯度的具有生物学活性的重组人KGF 2 。 展开更多
关键词 人角质细胞生长因子-2 基因克隆 表达 纯化 活性分析
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重组人角质细胞生长因子-2对实验秃毛大鼠的毛发再生作用 被引量:9
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作者 王泽 黄鹏煌 +3 位作者 赵海洋 李海燕 田海山 李校堃 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1741-1746,共6页
目的建立实验秃毛大鼠模型,研究重组人角质细胞生长因子-2(recombinant human keratinocyte growth factor-2,rhKGF-2)对实验秃毛大鼠的毛发再生作用。方法对大鼠背部以脱毛膏拔毛,随机分为7个组,即正常对照组、5%米诺地尔组、aFGF组、r... 目的建立实验秃毛大鼠模型,研究重组人角质细胞生长因子-2(recombinant human keratinocyte growth factor-2,rhKGF-2)对实验秃毛大鼠的毛发再生作用。方法对大鼠背部以脱毛膏拔毛,随机分为7个组,即正常对照组、5%米诺地尔组、aFGF组、rhKGF2高、中、低剂量组、0.9%生理盐水组。造模次日皮肤涂抹给药,以给药第1、5、9、14天为观察时间点,记录实验大鼠的体重、实验区毛长、实验区毛发生长状况。于第14天处死实验大鼠,取实验区皮肤进行组织病理学检查。结果体重方面:在第1、5、9、14天,与正常对照组相比,各组差异无显著性(P>0.05);毛长方面:与0.9%生理盐水组相比,在第5、9天,rhKGF2高、中剂量组存在显著性差异(P<0.05,P<0.01)。在第14天,高、中、低剂量组差异有显著性(P<0.05,P<0.01,P<0.05);毛重方面:在第14天,与0.9%生理盐水组相比,各组(正常对照组除外)差异有显著性(P<0.01);病理检查结果显示:rhKGF2具有促进实验秃毛大鼠毛囊新生与成熟的作用。结论 rh-KGF2具有促进实验秃毛大鼠毛发再生的作用。rhKGF2具有很好的临床应用前景。 展开更多
关键词 重组人角质细胞生长因子-2 秃毛大鼠 毛发再生作用 毛囊 临床应用
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重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化 被引量:3
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作者 邓林 刘孝菊 +5 位作者 龚守良 王会岩 田海山 王晓杰 马吉胜 李校堃 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期629-633,共5页
目的:构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1(rhKGF1dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法:利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1dest2... 目的:构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1(rhKGF1dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法:利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1dest23、pET22b-sumo-rhKGF1dest23、pET3c-rhKGF1dest23和pET3c-sumo-rhKGF1dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3)plysS、BL21(DE3)、BL21(DE3)StarplysS、origima(DE3)和BL21AI,筛选rhKGF1dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1dest23蛋白,Westernblotting法鉴定rhKGF1dest23蛋白。结果:pET22b-rhKGF1dest23质粒与BL21AI宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导,SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10%,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1dest23蛋白纯度为95%以上,Westernblotting法鉴定为rhKGF1dest23蛋白。结论:成功构建表达人KGF1dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1dest23蛋白。 展开更多
关键词 高效表达 重组截短人角质细胞生长因子-1 纯化
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不同物理和化学因素对重组人角质细胞生长因子2稳定性的影响 被引量:2
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作者 周鑫 王晓杰 +5 位作者 田海山 唐禄 焦悦 朱家楠 王莘 李校堃 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期518-522,共5页
目的:研究重组人角质细胞生长因子2(rhKGF-2)在不同保存条件下的稳定性,阐明温度、pH值、缓冲溶液及反复冻融因素对rhKGF-2稳定性的影响作用。方法:rhKGF-2在不同温度(-20℃、4℃、25℃、40℃)、pH值(pH4~9)、缓冲溶液(柠檬酸钠-柠檬... 目的:研究重组人角质细胞生长因子2(rhKGF-2)在不同保存条件下的稳定性,阐明温度、pH值、缓冲溶液及反复冻融因素对rhKGF-2稳定性的影响作用。方法:rhKGF-2在不同温度(-20℃、4℃、25℃、40℃)、pH值(pH4~9)、缓冲溶液(柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、吉斐氏缓冲溶液)及反复冻融条件下分别保存,采用RP-HPLC法检测rhKGF-2纯度,同时观察外观性状。结果:-20℃、4℃分别保存时,rhKGF-2的各项性质在观察期内都无明显变化;25℃时,rhKGF-2存放28d纯度较0h(100.00%)下降至(68.20±0.14)%;40℃时,rhKGF-2存放9h纯度较0h(100.00%)下降至(4.80±0.39)%。rhKGF-2(pH6.0)在25℃条件下保存90d纯度较0h(100.00%)下降至(79.20±0.12)%,与对照组(0h)比较差异有显著性(P<0.05);pH值为4.0、9.0的rhKGF-2液体在25℃条件下分别保存120h纯度较0h(100.00%)下降至(15.60±0.30)%和(67.30±0.10)%,与对照组(0h)比较差异有显著性(P<0.01)。rhKGF-2在柠檬酸缓冲液中25℃条件下保存60d纯度较0h(100.00%)下降至(79.20±0.15)%,与对照组(0h)比较差异有显著性(P<0.01)。rhKGF-2原液反复冻融后其纯度变化差异无显著性(P>0.05)。结论:rhKGF-2在低温和pH6.0~7.0中性条件下稳定。高温、偏酸性和偏碱性条件下均不利于rhKGF-2稳定。柠檬酸缓冲液有利于rhKGF-2稳定。反复冻融对rhKGF-2稳定性影响不明显。 展开更多
关键词 重组人角质细胞生长因子-2 纯度 稳定性
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重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定
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作者 冯成利 项琪 +4 位作者 张齐好 杨艳 柯实 黄亚东 苏志坚 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1526-1531,共6页
目的:利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人角质细胞生长因子(human keratinocyte growth factor,hKGF),为实现规模化生产重组hKGF奠定基础。方法:根据已报道的hKGF成熟肽序列,人工合成由毕赤酵母偏好密码子组成的编码hKGF的... 目的:利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人角质细胞生长因子(human keratinocyte growth factor,hKGF),为实现规模化生产重组hKGF奠定基础。方法:根据已报道的hKGF成熟肽序列,人工合成由毕赤酵母偏好密码子组成的编码hKGF的DNA片段后连接到分泌型表达质粒pPICZαA中,获得重组表达质粒并转化毕赤酵母X-33中进行表达。优化发酵条件,并利用5 L生物反应器进行中试发酵。发酵上清通过超滤及层析方法分离纯化重组蛋白,并利用MMT法检测其对恒河猴肺上皮细胞的促增殖活性。结果:在20℃,甲醇诱导60 h后,获得分子量约为28 kD的目的蛋白,表达量约占菌体上清总蛋白的14.1%。发酵液经肝素亲和层析和Sephardex G-25分子筛分离获得纯度为95.0%以上的重组蛋白,得率为12 mg/L。该重组hKGF具有糖基化修饰,能显著促进恒河猴肺上皮细胞增殖,其ED50约为57μg/L。结论:利用毕赤酵母成功表达出糖基化修饰及具促恒河猴肺上皮细胞增殖活性的重组hKGF。 展开更多
关键词 人角质细胞生长因子 毕赤酵母
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重组人角质细胞生长因子-Ⅰ的聚乙二醇修饰及体外活性
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作者 冯一建 陈勇 +4 位作者 张增涛 黄程 李红亮 胡春兰 范开 《重庆理工大学学报(自然科学)》 CAS 2012年第4期40-44,共5页
研究大肠杆菌表达的重组人角质细胞生长因子-Ⅰ型N端缺失突变体(△N23KGF-Ⅰ)的mPEG-马来酰亚胺(mPEG-maleimide、mPEG-Mal)修饰工艺及修饰位点和初步体外生物活性。首先修饰得到聚乙二醇化的△N23KGF-Ⅰ,然后对△N23KGF-Ⅰ作还原和非... 研究大肠杆菌表达的重组人角质细胞生长因子-Ⅰ型N端缺失突变体(△N23KGF-Ⅰ)的mPEG-马来酰亚胺(mPEG-maleimide、mPEG-Mal)修饰工艺及修饰位点和初步体外生物活性。首先修饰得到聚乙二醇化的△N23KGF-Ⅰ,然后对△N23KGF-Ⅰ作还原和非还原质量肽图,确定其各肽段,对△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K做还原质量肽图,确定修饰位点。最后,通过BAF-3细胞对△N23KGF-Ⅰ国际标准品、△N23KGF-Ⅰ、△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K测活。结果表明,在尿素环境下,mPEG-MAl被均一修饰在△N23KGF-I的Cys40位。与国际活性标准品相比,△N23KGF-Ⅰ的活性保留了116%,△N23KGF-Ⅰ-m PEG-Mal-20K的活性保留了36%。 展开更多
关键词 重组人角质细胞生长因子 质量肽图 聚乙二醇修饰
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重组人角质细胞生长因子Ⅰ型缺失突变体二硫键配对与生物活性 被引量:3
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作者 张增涛 陈清 +2 位作者 罗岚 曹宇 范开 《重庆理工大学学报(自然科学)》 CAS 2010年第5期44-49,53,共7页
研究了大肠杆菌表达的重组Ⅰ型人角质细胞生长因子缺失突变体(△23KGF-Ⅰ)二硫键的配对形式及生物活性。结果表明,重组大肠杆菌可溶性表达的△23KGF-Ⅰ中Cys40,Cys102和Cys106三个游离半胱氨酸间无二硫键形成,经铜离子处理形成Cys102-Cy... 研究了大肠杆菌表达的重组Ⅰ型人角质细胞生长因子缺失突变体(△23KGF-Ⅰ)二硫键的配对形式及生物活性。结果表明,重组大肠杆菌可溶性表达的△23KGF-Ⅰ中Cys40,Cys102和Cys106三个游离半胱氨酸间无二硫键形成,经铜离子处理形成Cys102-Cys106配对的二硫键,且经体内外活性研究,发现含二硫键配对的△23KGF-Ⅰ比不含二硫键形式的活性分别高40%和70%左右。 展开更多
关键词 人角质细胞生长因子突变体 二硫键 生物活性
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重组人角质细胞生长因子2对辽宁绒山羊血清KGF-2浓度的影响 被引量:1
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作者 孙亚波 朱延旭 +5 位作者 冀红芹 贾富勃 王春艳 吉尚雷 全治国 刘媛缘 《现代畜牧兽医》 2022年第6期11-17,共7页
研究旨在探讨不同处理方式给药后羊血清角质细胞生长因子2 (KGF-2)的浓度变化趋势,为重组人角质细胞生长因子2 (rhKGF-2)调控羊绒生长筛选合适的处理方法和剂量提供参考。试验选择24只5~7月龄、体重为(25.76±1.94) kg的辽宁绒山羊... 研究旨在探讨不同处理方式给药后羊血清角质细胞生长因子2 (KGF-2)的浓度变化趋势,为重组人角质细胞生长因子2 (rhKGF-2)调控羊绒生长筛选合适的处理方法和剂量提供参考。试验选择24只5~7月龄、体重为(25.76±1.94) kg的辽宁绒山羊,公、母各半,随机分为4组,每组6个重复,每个重复1只羊。以皮下注射方式,试验1组注射rhKGF-2胶原蛋白溶液,试验2组注射rhKGF-2温敏感凝胶溶液,试验3组注射rhKGF-2生理盐水溶液,试验4组为对照组,不做rhKGF-2处理。共设3个试验周期,每个周期18 d;依次设置低、中、高(10、20、30μg/kg)等3个剂量,每个周期开始时一次性注射18 d用量;研究不同给药方式和剂量对注射后血清KGF-2浓度变化的影响,探讨适宜的给药方式和剂量。结果显示:以胶原蛋白溶液和温敏感凝胶溶液形式皮下注射rhKGF-2后,血清KGF-2浓度先增加后降低,呈近似抛物线形式变化;以生理盐水溶液形式给药后,血清KGF-2浓度迅速升高达到峰值后断崖式直线下降。随着处理剂量增加,3个试验组血清KGF-2浓度峰值出现的时间均向后延迟,KGF-2高浓度维持时间延长;在30μg/kg的剂量时,试验1组的上述两个时间参数为90和426 h,试验2组为138和426 h,试验3组为42和138 h。对于同一种处理方式,剂量增加可使血清KGF-2浓度绝对值增加。研究表明,通过外源供给方式给绒山羊补充KGF-2,增加供给剂量能够提高血清KGF-2绝对浓度、延迟峰值出现时间、延长高浓度维持时间;以胶原蛋白溶液和温敏感凝胶的方式补充KGF-2效果相近,但考虑到可操作性,以前者的效果更好。 展开更多
关键词 角质细胞生长因子2 辽宁绒山羊 重组人角质细胞生长因子2
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重组人KGF-1蛋白的表达、纯化及活性研究 被引量:3
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作者 周昭 范清林 宋礼华 《生物学杂志》 CAS CSCD 2016年第1期13-16,20,共5页
在大肠杆菌中表达可溶性的重组人rh KGF-1蛋白,研究其生物学活性,为rh KGF-1蛋白进一步制药提供基础。合成ΔN23 rh KGF-1(N端缺失23个氨基酸残基的rh KGF-1形式)的基因序列,应用重叠PCR技术,将其与poly His-sumo标签基因序列拼接。构... 在大肠杆菌中表达可溶性的重组人rh KGF-1蛋白,研究其生物学活性,为rh KGF-1蛋白进一步制药提供基础。合成ΔN23 rh KGF-1(N端缺失23个氨基酸残基的rh KGF-1形式)的基因序列,应用重叠PCR技术,将其与poly His-sumo标签基因序列拼接。构建重组表达质粒p ET30a-6His-sumo-rh KGF1,转入E.coli BL21(DE3)中,表达融合蛋白。融合蛋白经Ni-NTA纯化后,切除SUMO标签,再经Ni-NTA纯化获得ΔN23 rh KGF-1蛋白。CCK-8法测定其对人永生化表皮细胞(Ha Cat细胞)的促增殖作用。结果表明,成功构建了p ET30a-6His-sumo-rh KGF1表达质粒,测序结果与预期一致。实现了融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达,经纯化、酶切获得了ΔN23 rh KGF-1蛋白。制备的ΔN23 rh KGF-1蛋白具有促进Ha Cat细胞增殖的作用,EC50=6.11 ng/m L。 展开更多
关键词 重组人角质细胞生长因子-1 SUMO蛋白 原核表达
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KGF-1二硫键突变体对肝纤维化的保护作用
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作者 谢敏 万颖 +3 位作者 张增涛 何建军 杨黎 范开 《重庆理工大学学报(自然科学)》 CAS 2012年第4期45-49,共5页
观察KGF-1二硫键突变体对人肝星状细胞的抑制作用和其对试验性肝损伤的修复作用,同时探讨二硫键对蛋白质生物活性的影响。运用CCl4诱导的肝纤维化模型对△23KGF-1组、△23Ser102 KGF-1组(不含二硫键)和△23Ser102 C40-C106 KGF-1组(含... 观察KGF-1二硫键突变体对人肝星状细胞的抑制作用和其对试验性肝损伤的修复作用,同时探讨二硫键对蛋白质生物活性的影响。运用CCl4诱导的肝纤维化模型对△23KGF-1组、△23Ser102 KGF-1组(不含二硫键)和△23Ser102 C40-C106 KGF-1组(含二硫键)进行体内抗纤维化活性的比较,并研究其对人肝星状细胞系的抑制作用。结果表明,与模型组相比,KGF-1突变体的各项指标均优于模型组,并且△23Ser102 KGF-1可明显抑制人肝星状细胞系的生长,可见KGF-1突变体不含二硫键组对大鼠试验性肝损伤有明显保护作用。此外实验还证明二硫键的有无会直接影响蛋白质的生物活性。 展开更多
关键词 重组人角质细胞生长因子-1突变体 二硫键 肝纤维化 四氯化碳
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