本研究旨在克隆犏牛前列腺素D合成酶(prostagland D synthase,L-PGDS)基因序列,并检测其在不同组织及不同发育时期睾丸中的表达水平,从而为深入研究L-PGDS基因在犏牛睾丸发育过程中的作用机制提供依据。采集成年健康犏牛心脏、肝脏、脾...本研究旨在克隆犏牛前列腺素D合成酶(prostagland D synthase,L-PGDS)基因序列,并检测其在不同组织及不同发育时期睾丸中的表达水平,从而为深入研究L-PGDS基因在犏牛睾丸发育过程中的作用机制提供依据。采集成年健康犏牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、胃、大脑及不同发育时期犏牛睾丸组织:胎牛期(5~6月)、幼年期(1~2岁)、青春期(2.5~4岁)、老年期(7~9岁),Trizol法提取各组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增、克隆L-PGDS基因序列并利用相关生物学软件进行分析,利用实时荧光定量PCR检测犏牛各组织及4个不同发育阶段睾丸中L-PGDS基因mRNA的表达水平。结果显示,L-PGDS基因序列全长624 bp,包括完整的开放阅读框576 bp,编码191个氨基酸。同源性比对发现,犏牛与黄牛和绵羊的同源性最高,分别为99.28%和94.0%。系统进化树分析结果显示,犏牛与黄牛亲缘关系最近,其次是绵羊、马。L-PGDS蛋白为不稳定疏水蛋白,分子质量为21.229 ku,分子式为C953H1471N251O281S9,等电点为6.43,不稳定指数为47.25,不含跨膜区及信号肽,蛋白质二级结构预测显示α-螺旋、无规则卷曲、延伸链分别占25.65%、53.40%和20.94%。实时荧光定量PCR检测结果显示,L-PGDS基因在犏牛睾丸组织中特异性高表达,极显著高于其他组织(P<0.01);随着年龄增长L-PGDS基因mRNA在犏牛睾丸中呈先上升后下降趋势,其中在青春期相对表达量最高,极显著高于其他时期(P<0.01)。本研究结果为深入探究L-PGDS基因在犏牛睾丸发育过程中的作用机制提供了基础资料。展开更多
目的克隆一个新的人睾丸特异性基因。方法运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达。然后从包含该重...目的克隆一个新的人睾丸特异性基因。方法运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达。然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长cDNA序列。结果新基因全长1197bp,开放阅读框为504～806bp,定位于6p21.1-p21.2,编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性。克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRG1(testis development related gene1),GenBank登录号为DQ168992。结论电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因是行之有效的。展开更多
文摘目的克隆一个新的人睾丸特异性基因。方法运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达。然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长cDNA序列。结果新基因全长1197bp,开放阅读框为504～806bp,定位于6p21.1-p21.2,编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性。克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRG1(testis development related gene1),GenBank登录号为DQ168992。结论电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因是行之有效的。
