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人白细胞介素18cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达  被引量:11
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作者 聂晶 赵洪礼 +5 位作者 刘洪涛 马向杉 王洪军 宋承辉 张伟建 谭笑红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期188-189,共2页
关键词 人白细胞介素18 表达载体 RT-PCR 大肠杆菌 克隆 CDNA
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抗重组人白细胞介素18单克隆抗体的制备与特性研究 被引量:5
2
作者 马颖 邹全明 +2 位作者 朱永红 罗萍 毛旭虎 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期412-414,417,共4页
目的 :获得有生物活性的小鼠抗重组人白细胞介素 18(rhIL 18)单克隆抗体。方法 :采用重组hIL 18免疫BALB C小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并经多次克隆化。结果 :建立了 2株小鼠抗hIL 18单克隆抗体杂交瘤细胞 1C7和... 目的 :获得有生物活性的小鼠抗重组人白细胞介素 18(rhIL 18)单克隆抗体。方法 :采用重组hIL 18免疫BALB C小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并经多次克隆化。结果 :建立了 2株小鼠抗hIL 18单克隆抗体杂交瘤细胞 1C7和 1F5 ,染色体数目分别为 92条和 90条 ,所分泌的抗体分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型 ,腹水IgG抗体经亲和层析法纯化后纯度达 95 %以上 ,效价为 1× 10 - 4和 1× 10 - 5,Westernblot显示 2株单抗均能特异性识别 18 3kD处的rhIL 18蛋白。 1C7单抗的亲和常数Ka=1 7× 10 5,1F5的亲和常数Ka=1 3× 10 5。 2株单抗识别不同抗原表位。结论 :制备的 2株单抗为进一步研究IL 18的分子结构、生物学功能及其与免疫相关性疾病的关系提供了实验材料。 展开更多
关键词 抗重组人白细胞介素18 单克隆抗体 制备 特性 杂交瘤
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人白细胞介素18(hIL-18)的纯化及生物学活性的鉴定 被引量:3
3
作者 杨广民 方艳秋 +1 位作者 谭岩 刘力华 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第12期850-854,共5页
目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人IL 18(rhIL 18)蛋白 ,制备具有高纯度、高活性的rhIL 18。方法 :用IPTG诱导重组蛋白表达载体pKK2 2 3 3 hIL 18进行蛋白表达 ;菌体经超声破碎分离包含体 ,并对包含体进行洗涤、变性和复性处理 ,用DEAE ... 目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人IL 18(rhIL 18)蛋白 ,制备具有高纯度、高活性的rhIL 18。方法 :用IPTG诱导重组蛋白表达载体pKK2 2 3 3 hIL 18进行蛋白表达 ;菌体经超声破碎分离包含体 ,并对包含体进行洗涤、变性和复性处理 ,用DEAE SepharoseCL 6B阴离子交换柱纯化复性的rhIL 18;以人外周血单核淋巴细胞 ,通过T细胞增殖实验、1 2 5I UdR标记的细胞毒实验、ELISA方法检测细胞因子的产生量等方法 ,测定rhIL 18的生物学活性。结果 :在大肠杆菌中成功地诱导、表达了rhIL 18,SDS PAGE凝胶电泳分离显示在分子量大约 18 3kD处有一诱导蛋白带 ,Westernblot证明表达产物与抗IL 18单克隆抗体有特异性免疫反应 ;表达产物经纯化后纯度达 94 % ;表达的rhIL 18蛋白具有促进T细胞增殖、增强NK细胞细胞毒作用及诱导外周血单核淋巴细胞合成IFN γ的能力 ,基本上具有天然IL 18相同的生物学活性。结论 :为rhIL 18的获得及为进一步研究其生物学功能提供了一定的条件 ,并为将rhIL 18用于肿瘤的免疫生物治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 重组人白细胞介素18 凝胶过滤 T细胞 NK细胞 细胞因子
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含有重组人白细胞介素18基因的工程菌的产物表达和鉴定 被引量:1
4
作者 董宇清 李荣贵 +2 位作者 董春霞 赵进东 吴光耀 《北京大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2000年第2期271-274,共4页
The cDNA of human Interleukin\|18 was obtained by RT\|PCR from the mRNA of human peripheral blood cells.The DNA sequencing was performed and the DNA was cloned into expression vector pBV220.The overexpression was perf... The cDNA of human Interleukin\|18 was obtained by RT\|PCR from the mRNA of human peripheral blood cells.The DNA sequencing was performed and the DNA was cloned into expression vector pBV220.The overexpression was performed in E.coli HB101.The expressive product was purified through Sephadex G100 and identified by N\|terminal amino acid sequencing and Western blot. 展开更多
关键词 人白细胞介素18 工程菌 表达产物鉴定 基因重组
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鼻咽癌细胞中表达的人白细胞介素18(hIL-18)对鼻咽癌患者外周血CD8^+T细胞细胞毒活性增强作用的研究
5
作者 陶剑平 夏云飞 +2 位作者 张昌卿 李满枝 林学颜 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期36-39,共4页
目的:探讨人白细胞介素18在鼻咽癌细胞中的表达能否提高鼻咽癌病人外周血CD8+T细胞的杀伤活性以及作用途径。方法:构建人白细胞介素18的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HIL-18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE;以转染的SUNE细胞和未转染的 SUNE细胞... 目的:探讨人白细胞介素18在鼻咽癌细胞中的表达能否提高鼻咽癌病人外周血CD8+T细胞的杀伤活性以及作用途径。方法:构建人白细胞介素18的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HIL-18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE;以转染的SUNE细胞和未转染的 SUNE细胞为靶细胞,以鼻咽癌患者外周血的 CD8+T细胞为效应细胞,混合培养 12h,用 LDH释放法测定 CD8+T细胞的细胞毒活性;用免疫组化法测定混合培养物中 CD8+T细胞上 Perforin、Fas-L、Granzyme B的表达。结果:所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL-18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL-18的含量为(85±10)pg/ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL-18的含量低于5pg/ml。将表达hIL-18的SUNE细胞与鼻咽癌患者外周血CD8+T细胞混合培养12h后,CD8+T细胞的细胞毒活性显著增强(P<0.111),尤其是当效应细胞/靶细胞为10:1时,CD8+细胞对转染的SUNE细胞的裂解率高达46.7%,而CD8+T细胞对未转染的SUME细胞的裂解率仅为4.6%。免疫组化法表明,这种杀伤活性的增强与CD8+T细胞表达Perforin有关,而与Fas-L和Granzyme B途径无关。结论:hIL-18能显著增强鼻咽癌患者外周血口CD8+T细胞的体外杀伤活性,这种杀伤活性与 CDS8+细胞表达Perforin有关。 展开更多
关键词 人白细胞介素18 基因转染 基因表达 CD8^+T细胞 细胞 穿孔蛋白 鼻咽癌
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人白细胞介素18原核表达载体的构建及其表达
6
作者 杨玉英 纪丽丽 李士泽 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2007年第4期26-28,共3页
关键词 人白细胞介素18 原核表达载体 hIL-18 氨基酸残基 CDNA文库 前体蛋白 IFN-Γ 细胞因子
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重组人白细胞介素18基因的克隆及序列测定 被引量:1
7
作者 纪丽丽 杨玉英 +1 位作者 李士泽 闫邦样 《黑龙江八一农垦大学学报》 2005年第5期61-64,共4页
从正常人外周血液中提取RNA,然后反转录cDNA,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,自行设计并合成一对特异性引物,成功地扩增出hIL-18cDNA基因,并定向插入PGEM-T载体中,对其进行酶切分析及序列测定。酶切分析表明一约481bp的基因片断... 从正常人外周血液中提取RNA,然后反转录cDNA,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,自行设计并合成一对特异性引物,成功地扩增出hIL-18cDNA基因,并定向插入PGEM-T载体中,对其进行酶切分析及序列测定。酶切分析表明一约481bp的基因片断克隆至PGEM-T载体中,与理论设计的一致。测序结果表明克隆至PGEM-T中的IL-18cDNA包含成熟IL-18的全部编码序列,本研究结果将为今后hIL-18基因的表达及进一步在基因水平上探讨hIL-18的生物学功能提供物质基础。 展开更多
关键词 人白细胞介素18(hIL-18) CDNA 分子克隆 序列测定
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含RGD模体的人白细胞介素18(IL-18)突变体的酵母表达及其抗血小板聚集活性
8
作者 卢忠民 赵宝昌 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期775-780,共6页
利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL18)cDNA序列中插入GGC序列,使IL18第39位精氨酸残基和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体.此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichiapastoris酵母GS1... 利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL18)cDNA序列中插入GGC序列,使IL18第39位精氨酸残基和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体.此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichiapastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达.用SephadexG100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白.对该蛋白进行了血小板聚集抑制实验和对GPⅡbⅢa与Fn结合的抑制实验.含RGD模体的重组IL18(IL18RGD)显示了较强的体外抑制血小板聚集活性,IC50=8.8μmolL;并具有与GPⅡbⅢa的竞争结合活性,IC50=8.0μmolL.该含有RGD模体的重组IL18仍保存对PBMC诱导产生IFNγ能力.结果表明,此IL18RGD嵌合体在具有抗炎,抗感染的同时增添了新的抑制血小板聚集功能. 展开更多
关键词 IL-18 RGD模体 毕赤酵母 血小板聚集 人白细胞介素18
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白细胞介素-18基因肌肉注射产生明显抗肿瘤作用(英文) 被引量:5
9
作者 张国荣 赵建增 +6 位作者 张晋东 王小平 陈涛 朱美财 刘亚宁 姜树强 王哲 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期7-13,共7页
为了探讨人白细胞介素 (h IL ) - 1 8基因转导的抗肿瘤作用 ,构建了 h IL- 1 8c DNA真核表达质粒载体 pc DNA3/h IL- 1 8.将 pc DNA3/h IL- 1 8经脂质体包裹 ,按照 1 0 0μg/只的剂量注射入雄性Balb/c小鼠后肢肌肉 ,在设定时间处死小鼠... 为了探讨人白细胞介素 (h IL ) - 1 8基因转导的抗肿瘤作用 ,构建了 h IL- 1 8c DNA真核表达质粒载体 pc DNA3/h IL- 1 8.将 pc DNA3/h IL- 1 8经脂质体包裹 ,按照 1 0 0μg/只的剂量注射入雄性Balb/c小鼠后肢肌肉 ,在设定时间处死小鼠取注射部位肉提取总 RNA,应用半定量反转录聚合酶链反应 (RT- PCR)及免疫组化法检测了 h IL- 1 8m RNA及其蛋白质在小鼠肌肉中不同时间点的表达水平 .随后 30只雄性 Balb/c小鼠于基因注射后第 7d腹部皮下 (i.d.)或腹腔内 (i.p.)接种 1×1 0 5个同系小鼠 S- 1 80肉瘤细胞 .观察了 S- 1 80肿瘤细胞在腹腔及皮下的生长情况、小鼠体重、肿瘤重量及存活时间 .结果发现 ,pc DNA3/h IL- 1 8注射后 2 d能检测到 h IL- 1 8m RNA表达 ,第 7d表达量较高 ,第 2 8d仍有 h IL- 1 8m RNA表达 .免疫组化染色显示了注射部位散在有 h IL- 1 8蛋白质颗粒 .h IL- 1 8基因注射组小鼠体重、肿瘤重量均比对照组轻 (P值分别小于 0 .0 0 5、0 .0 5) ,存活时间比对照组延长 .结果显示 ,真核表达系统 pc DNA3/h IL - 1 8经脂质体包裹肌注后能有效表达 ,具有明显的抑制肿瘤生长作用 . 展开更多
关键词 人白细胞介素-18 肌肉注射 肿瘤 基因治疗
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人白细胞介素-18真核表达载体的构建及测序分析 被引量:7
10
作者 王福祥 孙永涛 李光玉 《医学研究生学报》 CAS 2004年第2期111-113,共3页
目的 :构建含有人白细胞介素 18(IL 18)基因的真核表达载体 ,并对其进行测序分析。 方法 :通过分子克隆技术 ,将IL 18基因插入真核表达载体 pVAX1中 ,构建真核表达载体pVAX1 IL 18,并经BamHⅠ /EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。利用Blast程... 目的 :构建含有人白细胞介素 18(IL 18)基因的真核表达载体 ,并对其进行测序分析。 方法 :通过分子克隆技术 ,将IL 18基因插入真核表达载体 pVAX1中 ,构建真核表达载体pVAX1 IL 18,并经BamHⅠ /EcoRⅠ双酶切及测序鉴定。利用Blast程序 ,搜索NCBIGenBank中与重组质粒 (pVAX1 IL 18)中编码IL 18基因同源的序列。结果 :人IL 18基因成功地克隆至真核表达载体pVAX1中 ,pVAX1 IL 18中编码IL 18的序列与GenBank中所报道的IL 18编码序列完全一致。 结论 :成功地构建人IL 18基因真核表达载体 。 展开更多
关键词 人白细胞介素18 真核表达载体 DNA测序分析
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非融合型重组人白细胞介素-18的纯化及鉴定
11
作者 朱永红 邹全明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第16期1424-1427,共4页
目的 获得高纯度的重组人白细胞介素 18(rhIL 18)。方法 采用溶菌酶加超声破菌的方法抽提包涵体 ,以8mol/L尿素溶解包涵体 ,变性条件下以阴离子柱层析进行首步纯化 ,复性后再进行凝胶过滤层析。对纯化的样品进行了SDS PAGE、HPLC、N... 目的 获得高纯度的重组人白细胞介素 18(rhIL 18)。方法 采用溶菌酶加超声破菌的方法抽提包涵体 ,以8mol/L尿素溶解包涵体 ,变性条件下以阴离子柱层析进行首步纯化 ,复性后再进行凝胶过滤层析。对纯化的样品进行了SDS PAGE、HPLC、N端氨基酸序列、免疫印迹及生物学活性分析。结果 rhIL 18在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 ,所提取的包涵体中重组蛋白纯度可达到 80 %以上 ,包涵体经二步柱层析纯化后 ,HPLC分析纯度达 98%以上 ,SDS PAGE测定其分子质量约 19× 10 3 ,N端 15个氨基酸序列与预期一致 ,生物学活性分析证实纯化的rhIL 18具有诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力。结论 所建立的纯化rhIL 18的方法简便有效 ,为开展rhIL 18的结构活性关系研究及其大规模纯化打下了良好的基础。 展开更多
关键词 非融合型重组人白细胞介素-18 纯化 鉴定 溶菌酶 超声破菌 包涵体
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重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达 被引量:4
12
作者 杨莉莉 魏枫 +3 位作者 刘虹 李慧 于津浦 任秀宝 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1040-1043,共4页
目的:构建人白介素18(hIL-18)真核表达载体,在毕赤酵母中高效分泌表达hIL-18。方法:通过PCR法扩增得到hIL-18基因,构建其真核表达载体pPICZaC/hIL-18,电转化毕氏酵母X-33,PCR、SDS-PAGE、Western blot等方法筛选获得高效表达rhIL-18的... 目的:构建人白介素18(hIL-18)真核表达载体,在毕赤酵母中高效分泌表达hIL-18。方法:通过PCR法扩增得到hIL-18基因,构建其真核表达载体pPICZaC/hIL-18,电转化毕氏酵母X-33,PCR、SDS-PAGE、Western blot等方法筛选获得高效表达rhIL-18的工程菌株,疏水层析和阴离子交换层析纯化表达产物,并初步测定其生物学活性。结果:rhIL-18经甲醇诱导后其表达产量约为202mg/L。Western blot检测了rhIL-18的特异性结合活性;rhIl-18纯化后纯度达95%左右,并证明rhIL-18能够协同IL-2诱导PBMC分泌IFN-γ。结论:构建了重组hIL-18的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。 展开更多
关键词 人白细胞介素18 毕赤酵母 表达 纯化
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人IL-18cDNA克隆及原核表达 被引量:1
13
作者 安小惠 王一理 +2 位作者 耿宜萍 来宝长 司履生 《西安医科大学学报》 CSCD 北大核心 2001年第4期301-303,共3页
目的 从外周血单核细胞中克隆人IL 1 8成熟编码序列cDNA ,对其进行测序并构建原核表达载体 ,进行原核表达。方法 从人外周血单核细胞中分离总RNA ,进行RT PCR获得人IL 1 8cDNA。测序证实其结果正确后 ,构建原核表达载体。E .coli的表... 目的 从外周血单核细胞中克隆人IL 1 8成熟编码序列cDNA ,对其进行测序并构建原核表达载体 ,进行原核表达。方法 从人外周血单核细胞中分离总RNA ,进行RT PCR获得人IL 1 8cDNA。测序证实其结果正确后 ,构建原核表达载体。E .coli的表达产物通过SDS PAGE、WesternBlot证实。结果 所克隆的人IL 1 8cDNA编码序列经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致 ,细菌表达产物经SDS PAGE证实其大小约为 1 8.3KDa,WesternBlot进一步证实了所表达产物的正确性。结论 本研究结果为进一步探讨IL 1 8的生物学活性和特性奠定了基础 ,同时亦为利用人IL 1 8进行免疫基因治疗的研究打下了良好的基础。 展开更多
关键词 人白细胞介素18 基因克隆 原核表达 IL-18cDNA 细胞因子 克隆人
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