为了建立用荧光定量PCR检测人微血管内皮细胞纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）mRNA表达的方法。提取人微血管内皮细总RNA,经RT-PCR获得靶基因（PAI-1）及管家基因（β-actin）的PCR产物。纯化后,作为标准品梯度稀释,采用SYBR Green I定...为了建立用荧光定量PCR检测人微血管内皮细胞纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）mRNA表达的方法。提取人微血管内皮细总RNA,经RT-PCR获得靶基因（PAI-1）及管家基因（β-actin）的PCR产物。纯化后,作为标准品梯度稀释,采用SYBR Green I定量PCR检测,建立标准曲线。方法学考核参数为特异性、线性范围、灵敏性和重复性。分析全反式维甲酸对内皮细胞表达PAI-1 mRNA的干预效果。这种定量方法特异性好,检测的灵敏度达10^3拷贝,线性范围为10^4-10^10拷贝,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r^2〉0.990）,批内变异≤4.93%,批间变异≤9.12%。全反式维甲酸能上调内皮细胞PAI-1 mRNA的表达,且呈剂量依赖性。因此,荧光定量RT-PCR检测血管内皮细胞PAI-1基因表达的方法有助于溶栓药物药理学的研究和新药筛选。展开更多
目的研究重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402-Ala803,简称Ad-HIF-1α-564/402/803)对体外血管新生的影响。方法将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病...目的研究重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402-Ala803,简称Ad-HIF-1α-564/402/803)对体外血管新生的影响。方法将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,终点稀释法测定病毒滴度,提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定三突变型HIF-1α基因;X-Gal染色法测定重组腺病毒转染效率;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null分别转染hMVECs后,观察hMVECs在Matrigel上毛细血管管腔样结构的形成情况;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null和PBS分别转染鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型后,利用Image Pro Plus6.0软件收集数据并计算各组CAM血管面积比。结果经PCR及基因测序鉴定,扩增纯化后的腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异,病毒滴度达1011～1012PFU/ml;X-gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定;Ad-HIF-1α-564/402/803转染hMVECs后Matrigel上的管腔数目显著多于Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null及对照组;基因转染CAM72h后,Ad-HIF-1α-564/402/803组CAM上微小血管数目较Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组明显增多;Ad-HIF-1α-564/402/803组血管面积比与Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组相比,差异有统计学意义(P值分别为0.01、0.000、0.000)。结论Ad-HIF-1α-564/402/803能明显促进hMVECs毛细血管管腔样结构的形成,同时可以促进CAM模型上微小血管新生,证实了Ad-HIF-1α-564/402/803在常氧情况下对血管新生有一定的促进作用。展开更多
文摘为了建立用荧光定量PCR检测人微血管内皮细胞纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）mRNA表达的方法。提取人微血管内皮细总RNA,经RT-PCR获得靶基因（PAI-1）及管家基因（β-actin）的PCR产物。纯化后,作为标准品梯度稀释,采用SYBR Green I定量PCR检测,建立标准曲线。方法学考核参数为特异性、线性范围、灵敏性和重复性。分析全反式维甲酸对内皮细胞表达PAI-1 mRNA的干预效果。这种定量方法特异性好,检测的灵敏度达10^3拷贝,线性范围为10^4-10^10拷贝,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r^2〉0.990）,批内变异≤4.93%,批间变异≤9.12%。全反式维甲酸能上调内皮细胞PAI-1 mRNA的表达,且呈剂量依赖性。因此,荧光定量RT-PCR检测血管内皮细胞PAI-1基因表达的方法有助于溶栓药物药理学的研究和新药筛选。
文摘目的研究重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402-Ala803,简称Ad-HIF-1α-564/402/803)对体外血管新生的影响。方法将前期构建的Ad-HIF-1α-564/402/803在HEK293A细胞中进行扩增,用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化,终点稀释法测定病毒滴度,提取病毒DNA,进行PCR及PCR产物测序鉴定三突变型HIF-1α基因;X-Gal染色法测定重组腺病毒转染效率;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null分别转染hMVECs后,观察hMVECs在Matrigel上毛细血管管腔样结构的形成情况;Ad-HIF-1α-564/402/803、Ad-HIF-1αnature、Ad-Null和PBS分别转染鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型后,利用Image Pro Plus6.0软件收集数据并计算各组CAM血管面积比。结果经PCR及基因测序鉴定,扩增纯化后的腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异,病毒滴度达1011～1012PFU/ml;X-gal染色显示MOI为100pfu/cell时,转染效率趋于稳定;Ad-HIF-1α-564/402/803转染hMVECs后Matrigel上的管腔数目显著多于Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null及对照组;基因转染CAM72h后,Ad-HIF-1α-564/402/803组CAM上微小血管数目较Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组明显增多;Ad-HIF-1α-564/402/803组血管面积比与Ad-HIF-1α-nature组、Ad-Null组、PBS组相比,差异有统计学意义(P值分别为0.01、0.000、0.000)。结论Ad-HIF-1α-564/402/803能明显促进hMVECs毛细血管管腔样结构的形成,同时可以促进CAM模型上微小血管新生,证实了Ad-HIF-1α-564/402/803在常氧情况下对血管新生有一定的促进作用。
