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稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立 被引量：2
1
作者 王鹤 于继云 李力 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1088-1092,共5页
目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加... 目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒58型 E6E7基因 稳定转染 小鼠黑色素瘤细胞
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人乳头瘤状病毒(HPV)58型及其疫苗的研究进展
2
作者 王鹤 李力 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期782-784,F0004,共4页
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。近10余年来以大规模人群为基础的流行病学资料显示：99%的宫颈癌中存在人乳头瘤状病毒（Human papillomavirus,HPV）DNA,高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生的首要因素... 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。近10余年来以大规模人群为基础的流行病学资料显示：99%的宫颈癌中存在人乳头瘤状病毒（Human papillomavirus,HPV）DNA,高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素。 展开更多
关键词 人乳头瘤状病毒 58型 宫颈癌发生 疫苗 妇科恶性肿瘤 女性恶性肿瘤 高危型hpv 流行病学
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人乳头瘤病毒(HPV)58型中和单克隆抗体的制备及初步应用 被引量：1
3
作者 刘艳春 张婷 +2 位作者 谢喜秀 包琦锋 许雪梅 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期93-98,共6页
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型是宫颈癌的主要诱因之一.HPV58在亚洲地区宫颈癌组织中的检出率仅次于HPV16/18.HPV58中和单克隆抗体可用于HPV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗的研究,并为病毒感染入侵机制的研究... 人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型是宫颈癌的主要诱因之一.HPV58在亚洲地区宫颈癌组织中的检出率仅次于HPV16/18.HPV58中和单克隆抗体可用于HPV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗的研究,并为病毒感染入侵机制的研究提供实验材料.本研究采用HPV58 L1 VLP免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞进行杂交瘤细胞的制备,通过VLP-ELISA和假病毒中和实验筛选杂交瘤细胞株;经rProtein A纯化阳性杂交瘤细胞培养上清获得单抗;采用ELISA测定型别特异性中和单抗的亲和力,采用相加实验及变性VLP-ELISA分析单抗识别表位的性质;选取高亲和力单抗建立定量分析HPV58 L1 VLP的ELISA方法.获得了2株HPV58特异性中和单抗XM-22和XM-23,亲和常数分别为2.7×107mol-1.L和1.9×106mol-1.L,二者识别表位可能不同.同时获得2株具有交叉中和活性的单抗XM-21和XM-24,除可较高水平中和HPV58外,还可分别交叉中和亲缘关系较远的HPV18和HPV6.以XM-22建立的ELISA方法定量分析HPV58 L1 VLP的检测范围为0.05μg/mL～0.40μg/mL.本研究建立的ELISA方法可用于HPV58 L1 VLP疫苗生产的质量控制研究,获得的4株具有不同特点的中和单抗可用于HPV58感染入侵机制的研究. 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒58型 中和单克隆抗体 ELISA
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人乳头瘤病毒58型衣壳蛋白的表达及其抗体制备 被引量：2
4
作者 王丽娜 宋文龄 +2 位作者 陈伟 姜艳芳 付艳 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期283-286,共4页
目的:构建人乳头瘤病毒5 8型(hpv5 8)衣壳蛋白L1的杆状病毒 昆虫细胞表达系统。方法:用杆状病毒 昆虫细胞表达系统大量表达HPV5 8L1蛋白,并用HPV5 8L1病毒相似颗粒(VLP)免疫BALB c小鼠制备特异性抗血清。结果:HPV5 8L1蛋白在SF9细胞中... 目的:构建人乳头瘤病毒5 8型(hpv5 8)衣壳蛋白L1的杆状病毒 昆虫细胞表达系统。方法:用杆状病毒 昆虫细胞表达系统大量表达HPV5 8L1蛋白,并用HPV5 8L1病毒相似颗粒(VLP)免疫BALB c小鼠制备特异性抗血清。结果:HPV5 8L1蛋白在SF9细胞中被高效表达,其相对分子质量为5 5kD ;CsCl超速离心结合蔗糖密度超速离心可纯化此蛋白。在电镜下可见纯化的病毒衣壳蛋白L1形成VLP。用其免疫小鼠制备的相应抗体能与HPV5 8L1特异性结合。结论:成功表达了HPV5 8衣壳蛋白L1,并制备出高滴度的抗体。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒58型 主要衣壳蛋白L1 杆状病毒.昆虫细胞表达系统 病毒相似颗粒
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人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要衣壳蛋白L1的可溶性表达及应用
5
作者 陈玉梅 栗宁 +6 位作者 薛明岩 周景明 祁艳华 殷佳佳 张雨晴 李昱雅 王爱萍 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期553-558,共6页
目的原核表达获得人乳头瘤病毒58型主要衣壳蛋白L1(HPV58 L1)并进行鉴定。方法将HPV58 L1蛋白的重组表达菌pE⁃SUMO⁃58 L1(BL21)经IPTG进行诱导表达,SDS⁃PAGE及Western blot法鉴定重组SUMO⁃58 L1蛋白的表达情况;经Ni柱纯化获得重组SUMO⁃5... 目的原核表达获得人乳头瘤病毒58型主要衣壳蛋白L1(HPV58 L1)并进行鉴定。方法将HPV58 L1蛋白的重组表达菌pE⁃SUMO⁃58 L1(BL21)经IPTG进行诱导表达,SDS⁃PAGE及Western blot法鉴定重组SUMO⁃58 L1蛋白的表达情况;经Ni柱纯化获得重组SUMO⁃58 L1蛋白,经泛素样蛋白酶1(ULP1)酶切去除SUMO标签获得重组HPV58 L1蛋白,红细胞凝集试验(HA)验证HPV58 L1蛋白活性;再将重组HPV58 L1蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA测定免疫血清效价,间接免疫荧光试验(IFA)检测免疫血清与HEK293T细胞瞬时表达的HPV58 L1蛋白的反应情况。结果重组蛋白SUMO⁃58 L1在大肠杆菌中可溶性表达量较高,其相对分子质量(M_(r))约72000。经Ni⁃NTA亲和纯化后,再用ULP1去除SUMO标签最终得到M_(r)约58000的HPV58 L1蛋白,该重组蛋白具有类似于HPV病毒的凝集小鼠红细胞的血凝活性,其血凝价为1∶16。ELISA测定HPV58 L1蛋白免疫小鼠血清效价最高可达1∶10240,且免疫血清可与HEK293T细胞瞬时表达的HPV58 L1蛋白发生特异反应。结论经大肠杆菌表达系统成功获得了具有血凝活性的重组HPV58 L1蛋白,其免疫血清可用于免疫细胞化学检测真核细胞表达的HPV58 L1蛋白。 展开更多
关键词 人乳头瘤病58型(hpv58) L1蛋白 原核表达 间接免疫荧光技术(IFA)
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人乳头瘤病毒58型治疗性复合DNA疫苗载体的构建
6
作者 王鹤 于继云 李力 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1110-1114,共5页
目的:构建和表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型相关宫颈癌治疗用PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体。方法:将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GP... 目的:构建和表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型相关宫颈癌治疗用PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体。方法:将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。再将得到的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段插入新型疫苗载体PVAX1-IRES-hIL12中,构建PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体,流式细胞术、免疫荧光及ELISA分别检测该疫苗载体的表达。结果:经限制性内切酶鉴定及测序分析证实PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体构建成功。流式细胞术、免疫荧光及ELISA检测表明该疫苗载体中的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI及分子佐剂人白介素12(hIL12)能够同时实现真核表达。结论:PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12复合DNA疫苗载体可作为治疗HPV58相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗载体。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒58型 E6基因 E7基因 DNA疫苗载体 真核表达
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人乳头瘤病毒58型L1基因重组表达载体的构建及鉴定
7
作者 肖鹏 谷鸿喜 +3 位作者 李迪 魏兰兰 庄敏 凌虹 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2003年第2期64-64,共1页
关键词 人乳头瘤病毒58型 L1基因 重组表达载体 构建 鉴定
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HPV 58 L1改造基因的表达及其VLP产物抗血清制备 被引量：2
8
作者 范东升 张婷 +4 位作者 彭清林 杨丽君 许于飞 张然 许雪梅 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期677-682,共6页
高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)慢性持续性感染是诱发宫颈癌的主要病因.体外表达的HPV主要衣壳蛋白(L1)可自组装成病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),免疫后可诱导产生型别特异性中和抗体,有效保护机体免受同型病毒... 高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)慢性持续性感染是诱发宫颈癌的主要病因.体外表达的HPV主要衣壳蛋白(L1)可自组装成病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),免疫后可诱导产生型别特异性中和抗体,有效保护机体免受同型病毒的感染,因此可望预防病毒感染及感染相关的宫颈癌等病变.HPV58是诱发我国妇女宫颈癌的主要高危型病毒之一,目前尚无针对HPV58的疫苗问世.本研究联合采用多种策略对HPV 58 L1野生型基因进行改造,获得HPV 58 L1改造基因,命名为HPV 58 mL1,用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行HPV 58 mL1的表达,CsCl密度梯度离心法纯化获得HPV58 mL1重组蛋白,电镜分析结果显示,重组蛋白形成直径约55 nm的VLP.皮下免疫新西兰兔和豚鼠,ELISA检测显示,免疫动物产生高滴度针对HPV 58 mL1 VLP的抗血清,免疫斑点印迹检测显示,抗血清是针对VLP表面表位的.本研究表达了均一性好的HPV 58 mL1 VLP,并获得两个种属的HPV 58 mL1 VLP抗血清,为进一步研究有效预防HPV 58感染的疫苗打下基础. 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒58型 病毒样颗粒 基因改造 抗血清
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利用基因工程技术制备HPV58E7蛋白
9
作者 王德普 霍正浩 +1 位作者 张晨华 闫小飞 《西北大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期265-267,共3页
目的利用基因工程技术制备HPV58E7蛋白。方法设计E7基因片段特异性PCR引物,以HPV58全基因组为模板,经PCR扩增E7基因片段,利用pGEX-4T3表达质粒,构建pGEX-4T3/HPV58E7重组体,转化BL21宿主细胞,IPTG诱导表达带有GST标签的可溶性融合蛋白... 目的利用基因工程技术制备HPV58E7蛋白。方法设计E7基因片段特异性PCR引物,以HPV58全基因组为模板,经PCR扩增E7基因片段,利用pGEX-4T3表达质粒,构建pGEX-4T3/HPV58E7重组体,转化BL21宿主细胞,IPTG诱导表达带有GST标签的可溶性融合蛋白。经谷胱甘肽凝胶柱亲和层析纯化,凝血酶切GST标签。结果 SDS-PAGE分析显示在分子量约为40KD处有新生蛋白条带,经凝血酶消化融合蛋白,所获纯化HPV58E7蛋白与预期理论值相吻合。结论利用带有GST标签的原核表达系统及其相应纯化策略,获得HPV58E7蛋白的高效制备。 展开更多
关键词 GST-hpv58E7融合蛋白 hpv58E7蛋白 人乳头瘤病毒58型
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