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产气荚膜梭菌Beta1毒素通过P2X7-Ca^(2+)轴诱导巨噬细胞焦亡和铁死亡
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作者 张思雨 冉林武 +1 位作者 曾瑾 王玉炯 《南方医科大学学报》 北大核心 2025年第10期2126-2134,共9页
目的探索P2X7受体调控钙稳态失调介导的产气荚膜梭菌Beta1毒素毒理机制,为Beta1毒素致病机制的研究提供新思路。方法将20只10日龄BALB/c乳鼠随机分为对照组、rCPB1组、PD151746组、PD151746+rCPB1组,5只/组。对照组灌胃PBS,rCPB1组灌胃r... 目的探索P2X7受体调控钙稳态失调介导的产气荚膜梭菌Beta1毒素毒理机制,为Beta1毒素致病机制的研究提供新思路。方法将20只10日龄BALB/c乳鼠随机分为对照组、rCPB1组、PD151746组、PD151746+rCPB1组,5只/组。对照组灌胃PBS,rCPB1组灌胃rCPB1,PD151746组灌胃抑制剂PD151746,PD151746+rCPB1组先灌胃PD151746,2 h后再灌胃rCPB1。采用抗体芯片技术检测空肠的炎性因子的表达,在体内水平揭示钙稳态失调在Beta1毒素导致机体炎性损伤中的调控作用;进一步使用si-RNA-P2X7并经rCPB1处理THP-1细胞后,分别检测细胞存活率,Ca^(2+)、ROS和ATP水平,以及细胞焦亡和铁死亡的标志性检测指标,在体外水平揭示P2X7受体调控钙稳态失调介导的Beta1毒素的毒理机制。结果rCPB1灌胃乳鼠后,空肠组织中有多种炎性细胞因子表达升高(P<0.05),而用PD151746治疗后,其表达水平下降(P<0.05)。成功建立P2X7受体沉默细胞模型;P2X7受体沉默后,细胞存活率升高(P<0.05)、Ca^(2+)、活性氧、三磷酸腺苷水平以及细胞焦亡和铁死亡的标志性检测指标均下降(P<0.01)。结论P2X7受体介导的Beta1毒素功能性孔形成,能够进一步导致钙稳态失调,从而触发活性氧过度积累,进而诱导细胞焦亡和铁死亡共同发生。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌beta1毒素 P2X7受体 钙稳态失调 细胞焦亡 铁死亡
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产气荚膜梭菌Alpha毒素突变体的表达及单克隆抗体制备
2
作者 韩凤烨 刘莹 +7 位作者 潘晨帆 张乾义 陈小云 朱真 印春生 温永俊 王凤雪 杜吉革 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期442-450,共9页
[目的]获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin, CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。[方法]通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为... [目的]获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin, CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。[方法]通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为甘氨酸、第275、307和331位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第336位的天冬氨酸突变为天冬酰胺)的CPA基因片段,并将其克隆至pET-30a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(m6),并检测其毒力与免疫原性。将rCPA_(m6)作为包被抗原建立CPA抗体的间接ELISA检测方法,并用灭活的天然CPA作为免疫原按照常规方法免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,对其功能进行鉴定。[结果]重组蛋白rCPA_(m6)在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中能够以可溶性和包涵体两种形式表达。毒力测定结果显示,100μg/只rCPA_(m6)攻毒后,小鼠全部存活。免疫原性分析结果显示,1×最小致死量(MLD)的天然CPA攻毒后,对照组小鼠全部死亡,10和20μg/只rCPA_(m6)免疫组小鼠存活率为100%。利用rCPA_(m6)成功建立了CPA抗体的间接ELISA检测方法,并筛选获得4株分泌抗CPA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6E3、6B8、10A11、13D10,且4种细胞上清抗体效价均≥1∶3 200,其中单克隆抗体6B8细胞上清能中和天然CPA,且能与rCPA_(m6)发生反应。[结论]试验成功获得具有良好的安全性和免疫原性的重组蛋白rCPA_(m6),制备的CPA单克隆抗体6B8具有一定的中和活性及较高的特异性和敏感性。研究结果为CPA亚单位疫苗的研制提供了候选抗原,同时为CPA中毒症的治疗以及抗原/抗体检测方法的建立提供了物质基础。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌Alpha毒素(CPA) 突变体 原核表达 单克隆抗体
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产气荚膜梭菌α毒素-铁蛋白纳米颗粒抗原制备及其对小鼠的免疫原性评价
3
作者 赵慧玉 雷伊诺 +7 位作者 幸倩如 张珊 张广智 蒋卉 沈青春 丁家波 姜世金 范学政 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第9期4626-4637,共12页
本研究旨在制备产气荚膜梭菌α毒素-铁蛋白纳米颗粒抗原并评价其对小鼠的免疫原性。将带有D56G、H68G点突变和Spytag序列的α毒素全长基因和带有SpyCatcher序列的铁蛋白(Ferritin)基因片段分别克隆至原核表达载体pET 28a,后进行表达并... 本研究旨在制备产气荚膜梭菌α毒素-铁蛋白纳米颗粒抗原并评价其对小鼠的免疫原性。将带有D56G、H68G点突变和Spytag序列的α毒素全长基因和带有SpyCatcher序列的铁蛋白(Ferritin)基因片段分别克隆至原核表达载体pET 28a,后进行表达并对表达产物进行鉴定和纯化。对纯化后的α_(m2)ST进行细胞毒性、卵磷脂酶活性以及溶血活性分析。将纯化的α_(m2)ST和FeSC在体外对接,随后,将α毒素-铁蛋白(α_(m2)-Fe)对接产物和α_(m2)ST分别与佐剂混合后免疫小鼠。免疫后每周采集小鼠血清,检测IgG、IgG亚型抗体水平和中和效价,并在二免后28 d取脾细胞分析T细胞亚群和IFN-γ分泌水平。结果显示,在28℃条件下,α_(m2)ST和FeSC均以可溶性表达为主。α_(m2)ST未被检测出细胞毒性、卵磷脂酶活性和溶血活性,这说明α_(m2)ST已无毒性。将α_(m2)ST和FeSC体外对接后,经SDS-PAGE、TEM和DLS分析,证实α_(m2)-Fe形成直径32.7~50.7 nm的纳米颗粒,主峰为37.8 nm。小鼠免疫后,α_(m2)-Fe组能产生较高水平的IgG2a抗体(P<0.001);小鼠二免后21 d,α_(m2)-Fe组血清中和效价为64倍,显著高于α_(m2)ST组的32倍(P<0.05);二免后28 d,α_(m2)-Fe组脾细胞刺激后上清中的IFN-γ也高于α_(m2)ST组(P<0.05),流式细胞术分析显示α_(m2)-Fe组产生了较高比例的效应性CD8+T细胞(P<0.0001)。小鼠试验证实α_(m2)-Fe纳米颗粒抗原能有效刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 Α毒素 铁蛋白 纳米颗粒 免疫原性
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基于产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体双抗夹心ELISA方法的建立
4
作者 贾琼 高帅鹏 +4 位作者 修艳宇 任泓睿 张书茵 杨皓宇 范瑞文 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2906-2916,共11页
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)分泌的β毒素(CPB)可引起家畜和野生动物发生肠炎和肠毒血症以及人类严重的食物中毒。因此,开发有效的检测方法对于鉴定该菌株的感染至关重要。本研究通过建立产气荚膜梭菌CPB纳米抗体文库和噬菌... 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)分泌的β毒素(CPB)可引起家畜和野生动物发生肠炎和肠毒血症以及人类严重的食物中毒。因此,开发有效的检测方法对于鉴定该菌株的感染至关重要。本研究通过建立产气荚膜梭菌CPB纳米抗体文库和噬菌体展示技术淘选其特异性纳米抗体(命名为CPB-VHH),并对该纳米抗体半衰期、亲和性及温度稳定性进行评估。同时,分别以CPB-VHH为捕获抗体和羊驼抗CPB多克隆血清为检测抗体,建立双抗夹心ELISA方法,并对该方法临界值、灵敏性、交叉反应及准确性进行评价。结果显示,本研究筛选获得一种针对CPB的特异性纳米抗体CPB-VHH,其半衰期为2.152 h,亲和性常数为0.9612,在37℃以内的稳定性较好;以该抗体为基础,建立一种检测CPB的双抗夹心ELISA方法,临界值为0.183,灵敏度为0.977 ng·mL^(-1),准确率为92%,且与产气荚膜梭菌CPA、CPB、ETX重组蛋白、产单核细胞李氏杆菌(L.monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、火鸡沙门菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)无交叉反应,特异性良好。本研究建立的双抗夹心ELISA方法为B型和C型产气荚膜梭菌感染提供一种诊断方法,同时也为涉及CPB定量的疫苗研发及该毒素致病性研究提供指导。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 β毒素(CPB) 纳米抗体 ELISA
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产气荚膜梭菌致死性毒素致病机制和检测技术研究现状
5
作者 王虹迪 余聪 傅思武 《中国动物检疫》 2025年第2期66-72,共7页
产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病病原体,其产生的4种主要毒素(α、β、ε、ι)均具有较强的细胞毒性,宿主一旦感染该菌,病情进展迅速,死亡风险高,因此其毒素的致病机制及检测方法研究对于该病的早期诊断和及时干预具有重要意义。α... 产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病病原体,其产生的4种主要毒素(α、β、ε、ι)均具有较强的细胞毒性,宿主一旦感染该菌,病情进展迅速,死亡风险高,因此其毒素的致病机制及检测方法研究对于该病的早期诊断和及时干预具有重要意义。α毒素在气性坏疽的发生发展中起重要作用,β毒素可引起幼畜出血性坏死性肠炎,ε毒素毒力最强,与动物肠毒血症密切相关,ι毒素是该菌主要致死毒素中唯一的二元毒素,可引起动物坏死性肠炎、肠毒血症及人食物中毒。近期,基于ELISA和PCR技术衍生出大量产气荚膜梭菌致死性毒素检测技术,包括间接ELISA、双抗夹心ELISA、多重PCR、荧光定量PCR、微滴式数字PCR、环介导等温扩增等。这些检测技术各具特点,可根据具体需求、样品类型和检测目标进行选择。本文对产气荚膜梭菌4种主要毒素的致病机制和检测技术研究现状进行阐述,以期为“禁抗”后制定科学的产气荚膜梭菌感染防治措施提供依据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素 人兽共患病 致病机制 检测技术
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犊牛腹泻产气荚膜梭菌的毒素基因分型与耐药性分析——以山东省某规模奶牛场为例
6
作者 刘芝美 《中国乳业》 2025年第8期54-60,共7页
[目的]为查明山东省某规模化奶牛场腹泻犊牛病因及病原体耐药性,研究采集病料进行病原学鉴定和耐药性分析。[方法]无菌采集病死犊牛肠系膜、肺脏、脾脏等组织病料装入采样袋,共18份,通过细菌分离培养及生化试验,细菌16S rRNA进行PCR扩... [目的]为查明山东省某规模化奶牛场腹泻犊牛病因及病原体耐药性,研究采集病料进行病原学鉴定和耐药性分析。[方法]无菌采集病死犊牛肠系膜、肺脏、脾脏等组织病料装入采样袋,共18份,通过细菌分离培养及生化试验,细菌16S rRNA进行PCR扩增和毒素分型鉴定,运用K-B琼脂扩散纸法对分离菌株耐药性试验,PCR电泳检测14种耐药基因。[结果]结果显示,5株C型产气荚膜梭菌被检出,检出率为27.8%。分离菌对多种抗生素表现耐药性,β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类和氯霉素类耐药基因均有检出。[结论]研究结果表明,C型产气荚膜梭菌是引起奶牛场腹泻犊牛发病的致病菌,且对部分抗生素表现耐药性。该研究结果为奶牛场产气荚膜梭菌防控提供参考。 展开更多
关键词 腹泻犊牛 产气荚膜梭菌 毒素基因分型 耐药性
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野生动物园动物产气荚膜梭菌携带状况调查
7
作者 徐昀眺 郑九蓁 +5 位作者 李自盼 卞泓凯 潘新语 丁香 王海燕 刘文博 《动物医学进展》 北大核心 2025年第5期139-144,共6页
为了解不同野生动物群中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的携带情况、生物学特性及耐药情况,收集了江苏省某野生动物园内57种不同动物粪便样本进行厌氧培养、纯化和染色镜检进行初步鉴定、传代纯化,生化鉴定及16S rRNA基因序列... 为了解不同野生动物群中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的携带情况、生物学特性及耐药情况,收集了江苏省某野生动物园内57种不同动物粪便样本进行厌氧培养、纯化和染色镜检进行初步鉴定、传代纯化,生化鉴定及16S rRNA基因序列比对鉴定菌株;对分离的产气荚膜梭菌进行毒素型检测及耐药性分析。结果表明,分离到23株产气荚膜梭菌,均为A型。95.7%菌株对氨苄青霉素钠、美罗培南、万古霉素、替加环素、利奈唑胺敏感,其中由德保矮马(Debao pony)粪便中分离得到的产气荚膜梭菌对所试的8种抗菌药物均耐药。研究结果为今后野生动物中该病防控提供了一定参考。 展开更多
关键词 野生动物 产气荚膜梭菌 毒素基因 耐药性
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山东省某羊场产气荚膜梭菌分型鉴定与遗传进化分析
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作者 杨雪青 刘承军 +1 位作者 李朝进 邱晓倩 《中国动物检疫》 2025年第4期92-97,共6页
2024年9月山东省高唐县某山羊养殖场发生疑似产气荚膜梭菌感染疫情。为查明病原血清型及其遗传进化特征,以便采取针对性措施,采集病羊肝脏、肺脏、脾脏等组织样品进行细菌分离培养,然后对分离菌株进行16S rDNA PCR扩增测序,利用MEGA 7.... 2024年9月山东省高唐县某山羊养殖场发生疑似产气荚膜梭菌感染疫情。为查明病原血清型及其遗传进化特征,以便采取针对性措施,采集病羊肝脏、肺脏、脾脏等组织样品进行细菌分离培养,然后对分离菌株进行16S rDNA PCR扩增测序,利用MEGA 7.0软件构建系统进化树,利用产气荚膜梭菌7对毒素基因分型引物进行PCR鉴定分型,最后进行小鼠致病性试验。结果显示:共分离到5株符合产气荚膜梭菌特征的菌株;分离菌株经16S rDNA基因扩增得到1400 bp条带,与产气荚膜梭菌参考菌株相似性在99.6%以上,与上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124处于同一小分支,亲缘关系较近,与西藏牦牛源BG01、华东兔源SD14-02、云南奶山羊源KM-1、韩国驴源KSJ-28和北京人源1005-15098亲缘关系较远;分离菌株经毒素基因PCR检测得到402 bp阳性条带,符合α毒素基因特征,序列经BLAST比对发现与A型产气荚膜梭菌相似性为99.9%,证实为A型产气荚膜梭菌;小鼠致病性试验发现,分离菌株致病性较强。综上判定,导致本次山羊发病死亡的病原为A型产气荚膜梭菌。疫情提示,本地养殖场要加强饲养管理,定期进行畜禽舍和环境消毒,制定合理免疫计划,以防产气荚膜梭菌感染疫情的发生和传播。本试验为产气荚膜梭菌感染的诊治提供了参考。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 羊 系统进化树 毒素分型 进化分析
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产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的应用 被引量：2
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作者 张铭洋 张喜悦 +7 位作者 赵格 曲志娜 高宏伟 孙敏 程慧敏 徐佳微 王君玮 邹明 《山东农业科学》 北大核心 2024年第1期156-163,共8页
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L... 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L,退火温度为60℃。利用建立的ddPCR方法检测单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的DNA,结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。合成产气荚膜梭菌α-毒素基因,制成DNA标准品,选取3个稀释梯度的标准品进行重复试验,组内和组间变异系数均小于5%,证明该方法具有较好的重复性。采用7个稀释梯度的标准品进行重复检测,计算出该方法的检测限为12.39 copies/μL,定量限为33.97 copies/μL。通过对68份临床样品进行检测,证实该方法可用于临床,且用于检测质粒DNA时无明显的基质效应。应用ddPCR方法对标准品进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室进行定值,最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(GBW(E)091237)。α-毒素基因ddPCR方法的建立和DNA标准物的研制,为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 ddPCR α-毒素基因 标准物质 特异性 灵敏度 可重复性 定值
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产气荚膜梭菌毒素疫苗研究进展
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作者 王东 张思雨 +1 位作者 丁雅文 曾瑾 《中国感染控制杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期910-917,共8页
产气荚膜梭菌是一种引起人类和动物肠道感染和组织坏死的重要食源性病原体,致死因子是其产生的多种外毒素。合理使用抗菌药物及健康养殖需求的增加使疫苗预防更为重要。然而,传统的产气荚膜梭菌外毒素疫苗可能存在效果不稳定及残留毒素... 产气荚膜梭菌是一种引起人类和动物肠道感染和组织坏死的重要食源性病原体,致死因子是其产生的多种外毒素。合理使用抗菌药物及健康养殖需求的增加使疫苗预防更为重要。然而,传统的产气荚膜梭菌外毒素疫苗可能存在效果不稳定及残留毒素和甲醛等问题,引发了人们对这些疫苗安全性的担忧。该文系统介绍了产气荚膜梭菌的传统类毒素疫苗、基因工程重组疫苗及基于反向疫苗学和免疫信息学设计的表位肽疫苗最新研究进展,为研发制备有效、安全的新型产气荚膜梭菌毒素疫苗提供新思路。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素 流行病学 类毒素疫苗 重组疫苗
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C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究 被引量：6
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作者 许崇波 陈向东 +2 位作者 许崇利 逄越 高凤山 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期379-384,共6页
为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,... 为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株. 展开更多
关键词 C型产气荚膜梭菌 Α毒素基因 β1毒素基因 β2毒素基因 融合蛋白 免疫原性
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抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体1A8的基因克隆及序列测定 被引量：4
12
作者 赵宝华 许崇波 朱平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 2000年第1期30-33,共4页
应用RT_PCR技术,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(McAb) 的杂交瘤细胞1A8 中,扩增出抗体VH 和VL基因,用linker(Gly4Ser3)3 基因,将VH 和VL 基因连接成ScFv 基因,并将其克隆至pGEM_T载体中。经核甘酸序列分析证实... 应用RT_PCR技术,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(McAb) 的杂交瘤细胞1A8 中,扩增出抗体VH 和VL基因,用linker(Gly4Ser3)3 基因,将VH 和VL 基因连接成ScFv 基因,并将其克隆至pGEM_T载体中。经核甘酸序列分析证实,VH 和VL 基因及linker 基因拼接正确,基因全长729bp,经计算机分析,VH 和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH 和VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ(A) 展开更多
关键词 A型 产气荚膜梭菌 Α毒素 单链抗体 基因克隆
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从A型产气荚膜梭菌C57-1中发现β2毒素基因 被引量：3
13
作者 陈小云 万建青 +2 位作者 程君生 关孚时 张存帅 《中国兽药杂志》 2005年第5期6-9,共4页
为了进一步研究A型产气荚膜梭菌C571株的遗传学背景,应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从该菌株中扩增出大小为726bp的β2毒素基因(cpb2基因)的部分序列,并将其克隆入pMD18-T载体中。转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal选择培养,提取质粒... 为了进一步研究A型产气荚膜梭菌C571株的遗传学背景,应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从该菌株中扩增出大小为726bp的β2毒素基因(cpb2基因)的部分序列,并将其克隆入pMD18-T载体中。转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal选择培养,提取质粒,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实,该基因片段与文献报道的β2毒素基因序列一致。 展开更多
关键词 A型产气荚膜梭菌 毒素基因 聚合酶链式反应 核苷酸序列分析 IPTG 重组克隆 基因序列 文献报道 基因片段 遗传学 T载体 受体菌 Gal Amp
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产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达 被引量：1
14
作者 林初文 张松林 +4 位作者 刘磊 马永彪 韩文瑜 汪洋 沈志强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第2期324-330,共7页
利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。... 利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为54ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。 展开更多
关键词 B型产气荚膜梭菌中国标准株C58—1株 β1毒素基因 克隆表达
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肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析 被引量：3
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作者 黄紫贝 罗健雅 +4 位作者 赵以恒 李蒙 苏思元 赵振华 刘文博 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1298-1307,共10页
【目的】对江苏某大型白羽肉鸡场疑似产气荚膜梭菌感染造成大规模死亡的病例进行确诊。【方法】无菌采集病死鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肠道等病变组织,通过厌氧培养进行细菌分离和纯化,革兰染色镜检对分离菌株进行初步鉴定,通过16S r... 【目的】对江苏某大型白羽肉鸡场疑似产气荚膜梭菌感染造成大规模死亡的病例进行确诊。【方法】无菌采集病死鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肠道等病变组织,通过厌氧培养进行细菌分离和纯化,革兰染色镜检对分离菌株进行初步鉴定,通过16S rRNA基因序列分析确定属和演化关系,通过PCR扩增毒素基因确定分离株毒素型,通过动物致病性试验和药敏试验,确定其致病性和耐药表型并检测耐药基因。【结果】从4只病死鸡不同脏器中分离到了9株疑似菌,分离菌在产气荚膜梭菌鉴定培养基上呈黑色,16S rRNA分析得出9株分离菌与产气荚膜梭菌相似性最高可达99.60%。16S rRNA基因系统进化树显示,4株分离株与巴基斯坦鸡源产气荚膜梭菌(GenBank登录号:MN365136.1)具有较近的亲缘性,5株分离株与南非鸡源产气荚膜梭菌(GenBank登录号:OR494055)具有较近的亲缘性。毒素分型结果显示,5株为A型,2株为F型,2株为E型。致病性试验结果显示,小鼠全部死亡,表明该菌具有致死性。药敏试验结果显示,9株分离株均对头孢类抗生素敏感,耐药基因分析表明大环内酯类erm(B)(77.8%)和四环素类tetA(P)(55.6%)、tetB(P)(66.7%)为主要耐药基因。【结论】本研究从同一只病死鸡中分离到不同毒素型产气荚膜梭菌,且分离菌耐药情况较严重。研究结果为兽医临床鸡产气荚膜梭菌病防治提供了新的思路。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 鸡 毒素基因 耐药性
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B型产气荚膜梭菌C58-1株ε毒素基因序列分析与可溶性表达
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作者 林初文 张松林 +3 位作者 刘磊 马永彪 沈志强 韩文瑜 《动物医学进展》 北大核心 2015年第5期29-32,共4页
利用PCR技术从B型产气荚膜梭菌扩增出ε毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收984bp的ε毒素基因片段,将其定向克隆在载体PET-32a中,获得重组质粒pETε984。将pETε984转化至受体菌BL21(DE3)中。重组菌株经IPT... 利用PCR技术从B型产气荚膜梭菌扩增出ε毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收984bp的ε毒素基因片段,将其定向克隆在载体PET-32a中,获得重组质粒pETε984。将pETε984转化至受体菌BL21(DE3)中。重组菌株经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PACE分析。结果表明,重组目的蛋白在大肠埃希菌成功表达,融合蛋白大小为51ku,存在于细菌培养上清中,可溶性蛋白占菌体总蛋白相对含量的67.8%。序列分析表明C58-1株ε毒素蛋白序列与目前公布的所有B型和D型产气荚膜梭菌同源性均在99.7%以上,但ε毒素蛋白序列第321位出现了S→Y突变。研究结果为ε毒素蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌B型C58-1株 ε毒素基因 表达 序列分析
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产气荚膜梭菌β1毒素基因克隆与表达
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作者 张蓉蓉 艾地云 +5 位作者 张腾飞 罗青平 温国元 王红琳 汪宏才 邵华斌 《湖北畜牧兽医》 2016年第9期7-8,共2页
以C型产气荚膜梭菌中PCR扩增出β1毒素基因,构建了表达质粒p GEXKG-β1,将构建的KG-β1转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21/KG-β1。对重组菌株诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达毒素蛋白。
关键词 产气荚膜梭菌 β1毒素 克隆表达
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山东省羊源产气荚膜梭菌耐药性及分子遗传进化特征分析 被引量：7
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作者 徐吉荣 赵翠 +4 位作者 樊丽 武健 朱凤珠 伊惠 侯磊 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期593-600,共8页
为了解山东省羊源产气荚膜梭菌的流行及耐药情况,本研究于2022年11月~2023年3月,从山东省泰安、济宁和菏泽地区的3个规模化养羊场采集150份新鲜粪便样品,从中共分离到43株产气荚膜梭菌,分离率为28.7%(43/150)。利用PCR方法扩增产气荚膜... 为了解山东省羊源产气荚膜梭菌的流行及耐药情况,本研究于2022年11月~2023年3月,从山东省泰安、济宁和菏泽地区的3个规模化养羊场采集150份新鲜粪便样品,从中共分离到43株产气荚膜梭菌,分离率为28.7%(43/150)。利用PCR方法扩增产气荚膜梭菌分离株的毒素基因、耐药基因以及8对管家基因;利用K-B药敏纸片法检测分离菌的耐药性,并采用Fisher确切概率法统计分析分离株耐药表型与相应耐药基因之间的相关性。结果显示,产气荚膜梭菌分离株均携带cpa毒素基因,均为A型产气荚膜梭菌;对四环素和克林霉素耐药的菌株较多,分别占72.1%(31/43)和67.4%(29/43),对1~5种抗菌药耐药的菌株占2.3%~48.8%,多重耐药率为27.9%(12/43);四环素类耐药基因tetA(P)的检出率最高,为44.2%(19/43),其次为β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M,检出率为27.9%(12/43);耐药表型和耐药基因的符合率在41.2%~100%;根据管家基因的PCR扩增结果利用多位点序列分型将43株产气荚膜梭菌分为23个ST序列型,其中ST1和ST22为主要的流行型。本研究结果为山东地区羊源产气荚膜梭菌的监测、相关疫病的防控及养殖场抗菌药的合理使用提供参考依据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素分型 药敏试验 MLST分型
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产气荚膜梭菌C58-1株β毒素的克隆与表达
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作者 姚春阳 曹雨欣 +1 位作者 徐文豪 马先强 《今日畜牧兽医》 2021年第11期8-9,共2页
为研究魏氏梭菌β毒素蛋白在机体免疫应答中的作用和特点,参照GenBank:中KP064405.1B型魏氏梭菌β毒素基因,使用Primer5.0软件,设计合成了一对引物,应用PCR方法扩增出长为756bp的β毒素主要抗原区域,将该基因克隆到原核表达质粒pET 32a... 为研究魏氏梭菌β毒素蛋白在机体免疫应答中的作用和特点,参照GenBank:中KP064405.1B型魏氏梭菌β毒素基因,使用Primer5.0软件,设计合成了一对引物,应用PCR方法扩增出长为756bp的β毒素主要抗原区域,将该基因克隆到原核表达质粒pET 32a(+)中,经酶切鉴定、测序分析后,转化大肠杆菌BL21,并对其诱导表达。大肠杆菌表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白约为45KD,主要以包涵体形式存在。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 Β毒素 克隆 原核表达
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1株羊源产气荚膜梭菌的分离鉴定及毒素分型检测 被引量：7
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作者 张疏桐 胡天豪 +4 位作者 孙筱峰 陈思怀 张耕 宋振辉 郭建华 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2021年第6期58-61,66,共5页
为了鉴定某黑山羊养殖场坏死性肠炎的病原菌,无菌采集某坏死性肠炎死亡羊回肠内容物并进行细菌分离与鉴定。将厌氧培养获得的1株疑似致病菌进行培养特性观察、生化试验、药敏试验、小鼠致病性试验,16S rDNA PCR扩增及测序、产气荚膜梭... 为了鉴定某黑山羊养殖场坏死性肠炎的病原菌,无菌采集某坏死性肠炎死亡羊回肠内容物并进行细菌分离与鉴定。将厌氧培养获得的1株疑似致病菌进行培养特性观察、生化试验、药敏试验、小鼠致病性试验,16S rDNA PCR扩增及测序、产气荚膜梭菌毒力基因PCR试验。结果显示,经细菌生化试验、16S rDNA测序和产气荚膜梭菌毒力基因PCR试验均证实,该分离株为A型产气荚膜梭菌;小鼠致病性试验证实,该分离菌株致死量为5×107~5×108CFU;药敏试验结果表明,该菌株对氨基糖苷类抗生素有较强耐药性。本试验为后续产气荚膜梭菌α毒素分子进化分析及致病机制研究提供材料。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 羊 分离 鉴定 毒素分型
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