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产气荚膜梭菌Alpha毒素突变体的表达及单克隆抗体制备
1
作者 韩凤烨 刘莹 +7 位作者 潘晨帆 张乾义 陈小云 朱真 印春生 温永俊 王凤雪 杜吉革 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期442-450,共9页
[目的]获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin, CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。[方法]通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为... [目的]获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin, CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。[方法]通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为甘氨酸、第275、307和331位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第336位的天冬氨酸突变为天冬酰胺)的CPA基因片段,并将其克隆至pET-30a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(m6),并检测其毒力与免疫原性。将rCPA_(m6)作为包被抗原建立CPA抗体的间接ELISA检测方法,并用灭活的天然CPA作为免疫原按照常规方法免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,对其功能进行鉴定。[结果]重组蛋白rCPA_(m6)在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中能够以可溶性和包涵体两种形式表达。毒力测定结果显示,100μg/只rCPA_(m6)攻毒后,小鼠全部存活。免疫原性分析结果显示,1×最小致死量(MLD)的天然CPA攻毒后,对照组小鼠全部死亡,10和20μg/只rCPA_(m6)免疫组小鼠存活率为100%。利用rCPA_(m6)成功建立了CPA抗体的间接ELISA检测方法,并筛选获得4株分泌抗CPA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6E3、6B8、10A11、13D10,且4种细胞上清抗体效价均≥1∶3 200,其中单克隆抗体6B8细胞上清能中和天然CPA,且能与rCPA_(m6)发生反应。[结论]试验成功获得具有良好的安全性和免疫原性的重组蛋白rCPA_(m6),制备的CPA单克隆抗体6B8具有一定的中和活性及较高的特异性和敏感性。研究结果为CPA亚单位疫苗的研制提供了候选抗原,同时为CPA中毒症的治疗以及抗原/抗体检测方法的建立提供了物质基础。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌alpha毒素(cpa) 突变体 原核表达 单克隆抗体
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基于产气荚膜梭菌β毒素纳米抗体双抗夹心ELISA方法的建立
2
作者 贾琼 高帅鹏 +4 位作者 修艳宇 任泓睿 张书茵 杨皓宇 范瑞文 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2906-2916,共11页
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)分泌的β毒素(CPB)可引起家畜和野生动物发生肠炎和肠毒血症以及人类严重的食物中毒。因此,开发有效的检测方法对于鉴定该菌株的感染至关重要。本研究通过建立产气荚膜梭菌CPB纳米抗体文库和噬菌... 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)分泌的β毒素(CPB)可引起家畜和野生动物发生肠炎和肠毒血症以及人类严重的食物中毒。因此,开发有效的检测方法对于鉴定该菌株的感染至关重要。本研究通过建立产气荚膜梭菌CPB纳米抗体文库和噬菌体展示技术淘选其特异性纳米抗体(命名为CPB-VHH),并对该纳米抗体半衰期、亲和性及温度稳定性进行评估。同时,分别以CPB-VHH为捕获抗体和羊驼抗CPB多克隆血清为检测抗体,建立双抗夹心ELISA方法,并对该方法临界值、灵敏性、交叉反应及准确性进行评价。结果显示,本研究筛选获得一种针对CPB的特异性纳米抗体CPB-VHH,其半衰期为2.152 h,亲和性常数为0.9612,在37℃以内的稳定性较好;以该抗体为基础,建立一种检测CPB的双抗夹心ELISA方法,临界值为0.183,灵敏度为0.977 ng·mL^(-1),准确率为92%,且与产气荚膜梭菌CPA、CPB、ETX重组蛋白、产单核细胞李氏杆菌(L.monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、火鸡沙门菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)无交叉反应,特异性良好。本研究建立的双抗夹心ELISA方法为B型和C型产气荚膜梭菌感染提供一种诊断方法,同时也为涉及CPB定量的疫苗研发及该毒素致病性研究提供指导。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 β毒素(CPB) 纳米抗体 ELISA
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产气荚膜梭菌致死性毒素致病机制和检测技术研究现状
3
作者 王虹迪 余聪 傅思武 《中国动物检疫》 2025年第2期66-72,共7页
产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病病原体,其产生的4种主要毒素(α、β、ε、ι)均具有较强的细胞毒性,宿主一旦感染该菌,病情进展迅速,死亡风险高,因此其毒素的致病机制及检测方法研究对于该病的早期诊断和及时干预具有重要意义。α... 产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病病原体,其产生的4种主要毒素(α、β、ε、ι)均具有较强的细胞毒性,宿主一旦感染该菌,病情进展迅速,死亡风险高,因此其毒素的致病机制及检测方法研究对于该病的早期诊断和及时干预具有重要意义。α毒素在气性坏疽的发生发展中起重要作用,β毒素可引起幼畜出血性坏死性肠炎,ε毒素毒力最强,与动物肠毒血症密切相关,ι毒素是该菌主要致死毒素中唯一的二元毒素,可引起动物坏死性肠炎、肠毒血症及人食物中毒。近期,基于ELISA和PCR技术衍生出大量产气荚膜梭菌致死性毒素检测技术,包括间接ELISA、双抗夹心ELISA、多重PCR、荧光定量PCR、微滴式数字PCR、环介导等温扩增等。这些检测技术各具特点,可根据具体需求、样品类型和检测目标进行选择。本文对产气荚膜梭菌4种主要毒素的致病机制和检测技术研究现状进行阐述,以期为“禁抗”后制定科学的产气荚膜梭菌感染防治措施提供依据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素 人兽共患病 致病机制 检测技术
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野生动物园动物产气荚膜梭菌携带状况调查
4
作者 徐昀眺 郑九蓁 +5 位作者 李自盼 卞泓凯 潘新语 丁香 王海燕 刘文博 《动物医学进展》 北大核心 2025年第5期139-144,共6页
为了解不同野生动物群中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的携带情况、生物学特性及耐药情况,收集了江苏省某野生动物园内57种不同动物粪便样本进行厌氧培养、纯化和染色镜检进行初步鉴定、传代纯化,生化鉴定及16S rRNA基因序列... 为了解不同野生动物群中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的携带情况、生物学特性及耐药情况,收集了江苏省某野生动物园内57种不同动物粪便样本进行厌氧培养、纯化和染色镜检进行初步鉴定、传代纯化,生化鉴定及16S rRNA基因序列比对鉴定菌株;对分离的产气荚膜梭菌进行毒素型检测及耐药性分析。结果表明,分离到23株产气荚膜梭菌,均为A型。95.7%菌株对氨苄青霉素钠、美罗培南、万古霉素、替加环素、利奈唑胺敏感,其中由德保矮马(Debao pony)粪便中分离得到的产气荚膜梭菌对所试的8种抗菌药物均耐药。研究结果为今后野生动物中该病防控提供了一定参考。 展开更多
关键词 野生动物 产气荚膜梭菌 毒素基因 耐药性
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山东省某羊场产气荚膜梭菌分型鉴定与遗传进化分析
5
作者 杨雪青 刘承军 +1 位作者 李朝进 邱晓倩 《中国动物检疫》 2025年第4期92-97,共6页
2024年9月山东省高唐县某山羊养殖场发生疑似产气荚膜梭菌感染疫情。为查明病原血清型及其遗传进化特征,以便采取针对性措施,采集病羊肝脏、肺脏、脾脏等组织样品进行细菌分离培养,然后对分离菌株进行16S rDNA PCR扩增测序,利用MEGA 7.... 2024年9月山东省高唐县某山羊养殖场发生疑似产气荚膜梭菌感染疫情。为查明病原血清型及其遗传进化特征,以便采取针对性措施,采集病羊肝脏、肺脏、脾脏等组织样品进行细菌分离培养,然后对分离菌株进行16S rDNA PCR扩增测序,利用MEGA 7.0软件构建系统进化树,利用产气荚膜梭菌7对毒素基因分型引物进行PCR鉴定分型,最后进行小鼠致病性试验。结果显示:共分离到5株符合产气荚膜梭菌特征的菌株;分离菌株经16S rDNA基因扩增得到1400 bp条带,与产气荚膜梭菌参考菌株相似性在99.6%以上,与上海人源218002-301、印度豹源ATCC 13124处于同一小分支,亲缘关系较近,与西藏牦牛源BG01、华东兔源SD14-02、云南奶山羊源KM-1、韩国驴源KSJ-28和北京人源1005-15098亲缘关系较远;分离菌株经毒素基因PCR检测得到402 bp阳性条带,符合α毒素基因特征,序列经BLAST比对发现与A型产气荚膜梭菌相似性为99.9%,证实为A型产气荚膜梭菌;小鼠致病性试验发现,分离菌株致病性较强。综上判定,导致本次山羊发病死亡的病原为A型产气荚膜梭菌。疫情提示,本地养殖场要加强饲养管理,定期进行畜禽舍和环境消毒,制定合理免疫计划,以防产气荚膜梭菌感染疫情的发生和传播。本试验为产气荚膜梭菌感染的诊治提供了参考。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 羊 系统进化树 毒素分型 进化分析
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产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的应用 被引量：2
6
作者 张铭洋 张喜悦 +7 位作者 赵格 曲志娜 高宏伟 孙敏 程慧敏 徐佳微 王君玮 邹明 《山东农业科学》 北大核心 2024年第1期156-163,共8页
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L... 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L,退火温度为60℃。利用建立的ddPCR方法检测单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的DNA,结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。合成产气荚膜梭菌α-毒素基因,制成DNA标准品,选取3个稀释梯度的标准品进行重复试验,组内和组间变异系数均小于5%,证明该方法具有较好的重复性。采用7个稀释梯度的标准品进行重复检测,计算出该方法的检测限为12.39 copies/μL,定量限为33.97 copies/μL。通过对68份临床样品进行检测,证实该方法可用于临床,且用于检测质粒DNA时无明显的基质效应。应用ddPCR方法对标准品进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室进行定值,最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(GBW(E)091237)。α-毒素基因ddPCR方法的建立和DNA标准物的研制,为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 ddPCR α-毒素基因 标准物质 特异性 灵敏度 可重复性 定值
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产气荚膜梭菌毒素疫苗研究进展
7
作者 王东 张思雨 +1 位作者 丁雅文 曾瑾 《中国感染控制杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期910-917,共8页
产气荚膜梭菌是一种引起人类和动物肠道感染和组织坏死的重要食源性病原体,致死因子是其产生的多种外毒素。合理使用抗菌药物及健康养殖需求的增加使疫苗预防更为重要。然而,传统的产气荚膜梭菌外毒素疫苗可能存在效果不稳定及残留毒素... 产气荚膜梭菌是一种引起人类和动物肠道感染和组织坏死的重要食源性病原体,致死因子是其产生的多种外毒素。合理使用抗菌药物及健康养殖需求的增加使疫苗预防更为重要。然而,传统的产气荚膜梭菌外毒素疫苗可能存在效果不稳定及残留毒素和甲醛等问题,引发了人们对这些疫苗安全性的担忧。该文系统介绍了产气荚膜梭菌的传统类毒素疫苗、基因工程重组疫苗及基于反向疫苗学和免疫信息学设计的表位肽疫苗最新研究进展,为研发制备有效、安全的新型产气荚膜梭菌毒素疫苗提供新思路。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素 流行病学 类毒素疫苗 重组疫苗
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肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析 被引量：3
8
作者 黄紫贝 罗健雅 +4 位作者 赵以恒 李蒙 苏思元 赵振华 刘文博 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1298-1307,共10页
【目的】对江苏某大型白羽肉鸡场疑似产气荚膜梭菌感染造成大规模死亡的病例进行确诊。【方法】无菌采集病死鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肠道等病变组织,通过厌氧培养进行细菌分离和纯化,革兰染色镜检对分离菌株进行初步鉴定,通过16S r... 【目的】对江苏某大型白羽肉鸡场疑似产气荚膜梭菌感染造成大规模死亡的病例进行确诊。【方法】无菌采集病死鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肠道等病变组织,通过厌氧培养进行细菌分离和纯化,革兰染色镜检对分离菌株进行初步鉴定,通过16S rRNA基因序列分析确定属和演化关系,通过PCR扩增毒素基因确定分离株毒素型,通过动物致病性试验和药敏试验,确定其致病性和耐药表型并检测耐药基因。【结果】从4只病死鸡不同脏器中分离到了9株疑似菌,分离菌在产气荚膜梭菌鉴定培养基上呈黑色,16S rRNA分析得出9株分离菌与产气荚膜梭菌相似性最高可达99.60%。16S rRNA基因系统进化树显示,4株分离株与巴基斯坦鸡源产气荚膜梭菌(GenBank登录号:MN365136.1)具有较近的亲缘性,5株分离株与南非鸡源产气荚膜梭菌(GenBank登录号:OR494055)具有较近的亲缘性。毒素分型结果显示,5株为A型,2株为F型,2株为E型。致病性试验结果显示,小鼠全部死亡,表明该菌具有致死性。药敏试验结果显示,9株分离株均对头孢类抗生素敏感,耐药基因分析表明大环内酯类erm(B)(77.8%)和四环素类tetA(P)(55.6%)、tetB(P)(66.7%)为主要耐药基因。【结论】本研究从同一只病死鸡中分离到不同毒素型产气荚膜梭菌,且分离菌耐药情况较严重。研究结果为兽医临床鸡产气荚膜梭菌病防治提供了新的思路。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 鸡 毒素基因 耐药性
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山东省羊源产气荚膜梭菌耐药性及分子遗传进化特征分析 被引量：7
9
作者 徐吉荣 赵翠 +4 位作者 樊丽 武健 朱凤珠 伊惠 侯磊 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期593-600,共8页
为了解山东省羊源产气荚膜梭菌的流行及耐药情况,本研究于2022年11月~2023年3月,从山东省泰安、济宁和菏泽地区的3个规模化养羊场采集150份新鲜粪便样品,从中共分离到43株产气荚膜梭菌,分离率为28.7%(43/150)。利用PCR方法扩增产气荚膜... 为了解山东省羊源产气荚膜梭菌的流行及耐药情况,本研究于2022年11月~2023年3月,从山东省泰安、济宁和菏泽地区的3个规模化养羊场采集150份新鲜粪便样品,从中共分离到43株产气荚膜梭菌,分离率为28.7%(43/150)。利用PCR方法扩增产气荚膜梭菌分离株的毒素基因、耐药基因以及8对管家基因;利用K-B药敏纸片法检测分离菌的耐药性,并采用Fisher确切概率法统计分析分离株耐药表型与相应耐药基因之间的相关性。结果显示,产气荚膜梭菌分离株均携带cpa毒素基因,均为A型产气荚膜梭菌;对四环素和克林霉素耐药的菌株较多,分别占72.1%(31/43)和67.4%(29/43),对1~5种抗菌药耐药的菌株占2.3%~48.8%,多重耐药率为27.9%(12/43);四环素类耐药基因tetA(P)的检出率最高,为44.2%(19/43),其次为β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M,检出率为27.9%(12/43);耐药表型和耐药基因的符合率在41.2%~100%;根据管家基因的PCR扩增结果利用多位点序列分型将43株产气荚膜梭菌分为23个ST序列型,其中ST1和ST22为主要的流行型。本研究结果为山东地区羊源产气荚膜梭菌的监测、相关疫病的防控及养殖场抗菌药的合理使用提供参考依据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素分型 药敏试验 MLST分型
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南疆规模化养殖场羊产气荚膜梭菌的病原检测及分离鉴定
10
作者 万金隆 肖静 +3 位作者 郭嘉栋 杨江宇 杨梦娇 焦海宏 《现代畜牧兽医》 2024年第5期1-6,共6页
研究旨在了解南疆地区规模化羊场羊梭菌病的流行情况,无菌采集南疆巴州、阿克苏、和田等3个地区9个规模化羊场粪便和青贮饲料样品共421份,并采集3起疑似梭菌病病死羊组织样品6份,通过细菌分离培养、革兰氏染色,挑取纯化后的单菌落进行... 研究旨在了解南疆地区规模化羊场羊梭菌病的流行情况,无菌采集南疆巴州、阿克苏、和田等3个地区9个规模化羊场粪便和青贮饲料样品共421份,并采集3起疑似梭菌病病死羊组织样品6份,通过细菌分离培养、革兰氏染色,挑取纯化后的单菌落进行生化鉴定、16S rRNA基因鉴定、细菌分型和药敏试验。结果显示:427份样品中共分离出71株产气荚膜梭菌,总分离率为16.63%。其中119份青贮饲料样品中有25份阳性,检出率为21.01%(25/119);302份羊粪便样品中有40份阳性,检出率为13.24%(40/302);6份临床样品均显示阳性,检出率100.00%。对71株产气荚膜梭菌进行细菌分型鉴定,其中A型产气荚膜梭菌有57株,D型产气荚膜梭菌有4株,F型产气荚膜梭菌10株。药敏试验结果显示,分离株对临床常用药物青霉素等高度敏感,对磺胺异恶唑、多西环素、四环素、庆大霉素和黏菌素B耐药。研究表明,南疆地区规模化羊场产气荚膜梭菌的感染风险较高,需要在饲养管理上引起足够重视。 展开更多
关键词 南疆 规模化羊场 羊 产气荚膜梭菌 毒素基因 耐药性
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青岛地区规模化兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性研究 被引量：8
11
作者 吕长辉 王方山 +4 位作者 孙佳芝 郝海玉 刘雪慧 李超 王海荣 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期102-106,共5页
为了解青岛地区产气荚膜梭菌流行株近几年出现的毒素型、遗传多样性和耐药性变化,本研究选取2006年和2012年从青岛规模化兔场分离的产气荚膜梭菌菌株各15株,分别采用多重PCR、ERIC-PCR和药敏纸片法对分离菌株的毒素型、遗传多样性和耐... 为了解青岛地区产气荚膜梭菌流行株近几年出现的毒素型、遗传多样性和耐药性变化,本研究选取2006年和2012年从青岛规模化兔场分离的产气荚膜梭菌菌株各15株,分别采用多重PCR、ERIC-PCR和药敏纸片法对分离菌株的毒素型、遗传多样性和耐药性进行检测。结果表明:2006年分离的产气荚膜梭菌流行株均为A型,β2毒素阳性菌为2株(13.33%),而未检测到肠毒素和NetB毒素;2012年分离的15株产气荚膜梭菌流行株中A型14株、C型1株,β2毒素阳性菌为6株(40%),同样未检测到肠毒素和NetB毒素。将30株产气荚膜梭菌流行株通过ERIC-PCR方法分为14个亚型,其中2006年分离株分布于8个亚型,V型为主要流行型;2012年分离株也分布于其中8个亚型,主要流行型为Ⅲ型和Ⅺ型。产气荚膜梭菌2012年流行株比2006年流行株对先锋霉素、强力霉素、万古霉素、青霉素的耐药率大幅度提高。本研究结果显示:自2006年以来,青岛规模化兔场产气荚膜梭菌流行株在毒素基因、遗传多样性和耐药性上均发生了较大变化,这一结果为今后该地区兔场产气荚膜梭菌病的防控提供了依据。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素型 遗传多样性 耐药性 青岛地区
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C型产气荚膜梭菌β毒素基因克隆与核苷酸序列分析 被引量：8
12
作者 许崇波 王玉炯 +5 位作者 卫广森 王卓 冯书章 王文成 马成国 李尚波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第2期111-114,共4页
用ＰＣＲ技术，从含Ｃ型产气荚膜梭菌β毒素基因质粒ｐＢ１２中扩增出了０．９５Ｋｂ的β毒素基因，然后用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对其进行双酶切处理，最后将其定向连接在事先经同样内切酶处理的载体ｐＥＴ－２８ｃ（... 用ＰＣＲ技术，从含Ｃ型产气荚膜梭菌β毒素基因质粒ｐＢ１２中扩增出了０．９５Ｋｂ的β毒素基因，然后用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对其进行双酶切处理，最后将其定向连接在事先经同样内切酶处理的载体ｐＥＴ－２８ｃ（＋）中的相应位点上，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＢ２含有产气荚膜梭菌β毒素基因，确定了其全部的核苷酸序列。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 β毒素基因 基因克隆 核苷酸序列
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D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究 被引量：10
13
作者 王光华 蔺国珍 +4 位作者 郑福英 曹小安 宫晓炜 周继章 邱昌庆 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第3期36-41,共6页
利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET... 利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。 展开更多
关键词 D型产气荚膜梭菌 ε毒素 类毒素 免疫保护
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C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究 被引量：6
14
作者 许崇波 陈向东 +2 位作者 许崇利 逄越 高凤山 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期379-384,共6页
为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,... 为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株. 展开更多
关键词 C型产气荚膜梭菌 Α毒素基因 β1毒素基因 β2毒素基因 融合蛋白 免疫原性
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抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆、表达及其生物学活性(英文) 被引量：7
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作者 赵宝华 许崇波 +2 位作者 边艳青 段相林 朱平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期690-697,共8页
应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体... 应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中 .经核苷酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及linker基因拼接正确 ,ScFv 1A8基因全长为 72 6bp ,编码2 4 2个氨基酸 ,VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ (A)和轻链κⅣ家簇 .将ScFv 1A8基因克隆至表达载体pHOG2 1中 ,构建了重组质粒pHOG 1A8,然后转化至受体菌XL1 BLUE中 ,得到重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8) .ELISA检测和SDS PAGE分析表明 :经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8)的胞周质中 .经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE(pHOG 1A8)的蛋白表达产物占菌体可溶性蛋白的 1 2 % ,其相对分子量约为 31kD .ScFv的生物学活性研究表明 ,ScFv蛋白不但具有中和磷脂酶C的活性 。 展开更多
关键词 单链抗体小分子 基因克隆 表达 生物学活性 Α毒素 A型产气荚膜梭菌
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产气荚膜梭菌β毒素研究进展 被引量：9
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作者 霍萍萍 张聪敏 +4 位作者 胡明丽 赵宇亮 王琳 高洁 赵宝华 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第9期90-94,共5页
产气荚膜梭菌β毒素是引起人和动物食物中毒、气性坏疽和坏死性肠炎的一种致死性毒素。论文主要针对产气荚膜梭菌β毒素的基因和蛋白的分子结构及其致病机理进行介绍,对几种重要分子生物学检测技术的研究进展以及各自的优缺点进行分析,... 产气荚膜梭菌β毒素是引起人和动物食物中毒、气性坏疽和坏死性肠炎的一种致死性毒素。论文主要针对产气荚膜梭菌β毒素的基因和蛋白的分子结构及其致病机理进行介绍,对几种重要分子生物学检测技术的研究进展以及各自的优缺点进行分析,对产气荚膜梭菌的预防和治疗的方法进行了概括,为产气荚膜梭菌β毒素的进一步研究提供参考。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 β毒素基因 分子结构 致病机制 诊断治疗
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产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展 被引量：15
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作者 孙雨 王晓英 +5 位作者 董浩 曲萍 胡冬梅 赵柏林 石慧 宋晓晖 《中国草食动物科学》 CAS 2016年第2期58-62,共5页
产气荚膜梭菌也称魏氏梭菌,是引起气性坏疽、肠毒血症、出血性肠炎等反刍动物疾病的主要病原。该菌能够分泌α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν等多种外毒素,其中a、β、ε、ι毒素是主要的致病因子。产气荚膜梭菌引起的疾病... 产气荚膜梭菌也称魏氏梭菌,是引起气性坏疽、肠毒血症、出血性肠炎等反刍动物疾病的主要病原。该菌能够分泌α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν等多种外毒素,其中a、β、ε、ι毒素是主要的致病因子。产气荚膜梭菌引起的疾病通常发病急、死亡快,因此,疫苗免疫是预防该病的主要方法。近年来,随着对a、β、ε等毒素功能研究的深入,研究毒素相关的基因工程亚单位疫苗成为研究热点,并且有望弥补传统类毒素疫苗的安全性不高、稳定性差等缺点。文章从产气荚膜梭菌的病原学特点、主要外毒素的致病机制以及毒素相关疫苗的研究进展进行综述,以期为产气荚膜梭菌的综合防控和基因工程亚单位疫苗与核酸疫苗的研发提供一定的参考。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 外毒素 致病机制 疫苗
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D型产气荚膜梭菌ε毒素研究进展 被引量：8
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作者 高洁 张聪敏 +2 位作者 刘伟 赵宇亮 赵宝华 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第10期101-105,共5页
D型产气荚膜梭菌常引起新生羔羊痢疾和山羊、牛等家畜的肠毒血症,致死性强,对畜牧业造成很大的危害。ε毒素是D型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学的角度对该毒素的研究具有重要实际意义。论文主要对国内外关... D型产气荚膜梭菌常引起新生羔羊痢疾和山羊、牛等家畜的肠毒血症,致死性强,对畜牧业造成很大的危害。ε毒素是D型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学的角度对该毒素的研究具有重要实际意义。论文主要对国内外关于D型产气荚膜梭菌ε毒素分子生物学结构与性质,ε毒素引起的家畜肠毒血症以及对其作用靶器官肾脏和脑组织破坏的致病机理进行了介绍,对国内外D型产气荚膜梭菌ε毒素预防措施进行了综述,为研究D型产气荚膜梭菌ε毒素结构与功能的关系以及预防治疗动物肠毒血症提供参考。 展开更多
关键词 D型产气荚膜梭菌 ε毒素 毒性分子基础 肠毒血症 预防
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产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立 被引量：6
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作者 陈长俊 刘伟 +3 位作者 陈端端 秦贵平 林晓佳 王海荣 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期514-517,共4页
为建立产气荚膜梭菌α毒素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为检测抗体,建立了检测α毒素的DAS-ELISA。通过优化反应条件,建立标准曲线;... 为建立产气荚膜梭菌α毒素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为检测抗体,建立了检测α毒素的DAS-ELISA。通过优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。采用该方法测定产气荚膜梭菌α毒素的最低检测限为0.353倍的小鼠LD_(50),可定量范围为0.353~90.368倍小鼠LD_(50)。结果表明该DAS-ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可以用于大批量样品检测。初步应用结果显示:患产气荚膜梭菌病的兔群肠内容物中产气荚膜梭菌的α毒素水平显著高于健康兔群(p<0.05)。本研究检测α毒素的DAS-ELISA建立有助于畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌α毒素 双抗体夹心ELISA 兔产气荚膜梭菌病
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产气荚膜梭菌ι毒素研究进展 被引量：5
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作者 王琳 赵宇亮 +3 位作者 何建龙 霍萍萍 张聪敏 赵宝华 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第11期102-105,共4页
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种人兽共患病的病原体,能引起各种动物和人患气性坏疽,肠毒血症,羊和山羊羔羊痢疾等肠道疾病。该菌产生的毒素至少有16种之多,ι毒素是产气荚膜梭菌主要致死毒素中唯一的一种二元毒素,由一种... 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种人兽共患病的病原体,能引起各种动物和人患气性坏疽,肠毒血症,羊和山羊羔羊痢疾等肠道疾病。该菌产生的毒素至少有16种之多,ι毒素是产气荚膜梭菌主要致死毒素中唯一的一种二元毒素,由一种ADP核糖基转移酶组件(Ia)和一种绑定组件(Ib)组成,可引起羔羊、犊牛和家兔患肠毒血症。近年来,ι毒素引发的患肠毒血症的动物有向多而广发展的趋势,所以有必要对产气荚膜梭菌做更加深入的研究。论文就ι毒素的分子结构和功能、致病机制以及检测和预防进行了阐述,以期对今后有关ι毒素的研究有所帮助。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 ι毒素 结构与功能 致病机制 检测和预防
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