产单核细胞李氏杆菌内化素G单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立 被引量：3

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作者 马金锐 史文静 +8 位作者 田常青 董志杰 赵学慧 芝吉 曹青 魏衍全 宋维丽 薛惠文 苟惠天 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4069-4076,共8页

本研究旨在建立一种快速检测产单核细胞李氏杆菌的方法。通过PCR扩增产单核细胞李氏杆菌(LM)内化素G(InlG)基因,构建pET-32a-InlG重组表达载体,通过诱导表达获得InlG重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg·只^(-1)),经细胞融合、克... 本研究旨在建立一种快速检测产单核细胞李氏杆菌的方法。通过PCR扩增产单核细胞李氏杆菌(LM)内化素G(InlG)基因,构建pET-32a-InlG重组表达载体,通过诱导表达获得InlG重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg·只^(-1)),经细胞融合、克隆和筛选共获得了3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、1D2-1和2H10。经鉴定,其分泌抗体亚型均为IgG 1。利用制备的1D2-1作为捕获抗体,产单核细胞李氏杆菌兔多抗作为检测抗体,初步建立检测产单核细胞李氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法。Western blot结果显示3株单克隆抗体(mAb)与InlG均可发生特异性反应。双抗体夹心ELISA方法的特异性试验结果显示,与沙门菌、大肠杆菌、枯草杆菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌均不发生反应。灵敏度试验结果显示,该方法检测LM纯培养物的检测限为1.0×10^(6)CFU·mL^(-1)。重复性试验结果显示,各组变异系数在5%~10%之间(<10%)。综上,本研究利用抗内化素G蛋白的mAb和兔多抗建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于产单核细胞李氏杆菌感染的快速诊断检测。 展开更多

关键词 产单核细胞李氏杆菌 内化素G 单克隆抗体 酶联免疫吸附试验

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产单核细胞李氏杆菌Lm4b_02325/26双基因缺失株构建及部分生物学特性试验

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作者 任慧杰 马勋 +7 位作者 王静 刘彩霞 曾东东 寇丽君 史唯地 吕双飞 钱瑞宣 高盛杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2578-2587,共10页

旨在构建食源性产单核细胞李氏杆菌毒力岛4(LIPI-4)中的抗转录终止子(Lm4b_02325)和未知蛋白(Lm4b_02326)基因的双缺失株,研究Lm4b_02325/26基因对产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的部分生物学特性的影响。利用同源重组... 旨在构建食源性产单核细胞李氏杆菌毒力岛4(LIPI-4)中的抗转录终止子(Lm4b_02325)和未知蛋白(Lm4b_02326)基因的双缺失株,研究Lm4b_02325/26基因对产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的部分生物学特性的影响。利用同源重组技术构建LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株,测定LM928和LM928ΔLm4b_02325/26双缺失株在脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth, BHI)、不同EtOH浓度、不同NaCl浓度、不同pH、不同温度下的D_(600 nm),绘制生长曲线;RT-qPCR检测双基因缺失前后体外BHI培养环境下部分毒力因子转录水平;平板计数测定其对鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附、侵袭与胞内增殖情况;感染C57BL/6小鼠后检测肝、脾、脑组织中的细菌数量。结果表明,成功构建具有遗传稳定性的双缺失株LM928ΔLm4b_02325/26。在含0.5%~10%NaCl或3%~4.5%EtOH的培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异,在pH=5条件下,双缺失株的生长率显著高于野毒株,pH=9条件下双缺失株的生长率显著低于野毒株。在不同温度(4℃、37℃、42℃)BHI培养基中,双缺失株与野毒株生长没有明显差异。Lm4b_02325/26基因双缺失株在BHI培养基中毒力因子hly、inlC和PlcA极显著上调(P<0.01),mpl、inlB、actA、inlP、PlcB、prfA、SigB、iap和inlA极显著下调(P<0.01);双缺失株对RAW264.7细胞的黏附率(14.86%)和侵袭率(2.23%)明显低于野毒株的黏附率(22.93%)和侵袭率(4.28%)(P<0.01);3、6、12 h时胞内增殖数量极显著低于野毒株(P<0.01);双缺失株与野毒株感染小鼠后,载菌量在肝、脾中没有显著差异,在脑组织中双缺失株载菌量为10~4,高于野毒株的10~(3.07),差异极显著(P<0.01)。综上认为,LIPI-4的Lm4b_02325和Lm4b_02326基因参与LM毒力因子的表达和脑组织的定植能力,与弱酸强碱条件下适应力及对RAW264.7细胞的黏附、侵袭和胞内增殖有关。本研究为LIPI-4的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 产单核细胞李氏杆菌 双缺失株 黏附侵袭 胞内增殖 载菌量 生长曲线

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脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失对产单核细胞李氏杆菌致病性的影响

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作者 秦祎 胡文洁 +4 位作者 方小伟 郭骞 田篮鑫 刘芳 方春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期670-679,共10页

本文旨在构建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,探讨ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌致病力的影响。本研究利用同源重组技术构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,通过生物学特性试验探究ltaS基因缺失株对产单核细胞李氏杆菌生长能力和菌体... 本文旨在构建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,探讨ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌致病力的影响。本研究利用同源重组技术构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,通过生物学特性试验探究ltaS基因缺失株对产单核细胞李氏杆菌生长能力和菌体形态的影响,Western blot试验探究亲本株EGDe-prfA、缺失株ΔltaS对InlA和InlB在细菌表面的锚定情况;使用鸡胚成纤维DF-1细胞进行细胞黏附侵袭试验、小鼠RAW264.7细胞进行吞噬试验与巨噬细胞内增殖试验测定ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌侵染能力的影响;小鼠脏器细菌载量和小鼠存活试验评估ltaS基因缺失对产单核细胞李氏杆菌致病性的影响。结果显示:利用同源重组技术成功构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,生长曲线试验和光学显微镜观察发现ltaS基因不影响产单核细胞李氏杆菌在BHI中正常生长和细菌形态,通过Western blot试验验证ltaS基因缺失导致细菌表面毒力的InlA和InlB锚定量降低。细胞黏附侵袭试验结果表明,ΔltaS对DF-1的黏附率极显著低于亲本株EGDe-prfA(P<0.01)并且侵袭率也极显著低于亲本株EGDe-prfA(P<0.01);吞噬试验结果显示,小鼠巨噬细胞RAW264.7对ΔltaS的吞噬率与亲本株EGDe-prfA相比无显著性差异(P>0.05);而在增殖试验中,ΔltaS在RAW264.7中增殖量与亲本株EGDe-prfA存在显著差异(P<0.05)。小鼠致病力试验结果显示,经ΔltaS感染的小鼠的肝、脾内细菌载量均显著低于EGDe-prfA(P<0.01)并且EGDe-prfA感染后的小鼠96 h内全部死亡,而缺失株ΔltaS感染的小鼠存活率为80%,测定出亲本株EGDe-prfA半数致死量LD 50为1.7×104 CFU,缺失株ΔltaS半数致死量LD 50为7.49×106 CFU。综上所述,ltaS基因缺失显著减少表面InlA和InlB的锚定量,减弱产单核细胞李氏杆菌对DF-1细胞的黏附侵袭能力与RAW264.7内细菌增殖能力,并且降低对小鼠的致病性。 展开更多

关键词 产单核细胞李氏杆菌 磷壁酸 脂磷壁酸合成酶 基因缺失 致病性

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T6SS效应蛋白Tae4对金黄色葡萄球菌和产单核细胞李氏杆菌的抑菌作用

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作者 占乐杨 苟婧萱 +6 位作者 张曼琪 傅唯轩 兰守信 涂健 王振宇 邵颖 宋祥军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4660-4669,共10页

旨在探究Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion systems,T6SS)的毒力效应蛋白Tae4酰胺酶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)及产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)的抑菌作用。将pET-28a-Tae4重组质粒... 旨在探究Ⅵ型分泌系统(TypeⅥsecretion systems,T6SS)的毒力效应蛋白Tae4酰胺酶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)及产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)的抑菌作用。将pET-28a-Tae4重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(Escherichia coli BL21,E.coli BL21)进行目的蛋白诱导表达,优化IPTG的诱导时间、浓度、温度,最后纯化后的Tae4蛋白通过琼脂孔扩散试验、最小抑菌浓度测定、抗生素联用抑菌试验分别作用于S.aureus和L.monocytogenes。SDS-PAGE电泳结果显示,本试验中重组蛋白诱导表达最佳条件为:IPTG终浓度为0.5 mmol·L^(-1),16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为21 ku,可溶性表达于培养上清中。琼脂孔扩散试验结果显示,Tae4蛋白浓度500μg·mL^(-1)时S.aureus菌株均出现13mm以上抑菌圈,效果与菌株血清型有关,L.monocytogenes菌株均出现18mm以上抑菌圈;最小抑菌浓度试验结果显示,Tae4蛋白对S.aureus的MIC约为250μg·mL^(-1),对L.monocytogenes的MIC约为125μg·mL^(-1),点板法和微量肉汤稀释法结果一致;抗生素联用抑菌试验结果显示,Tae4蛋白与青霉素(penicillin,PG)联合使用均比单独使用的抑菌效果要好,且对L.monocytogenes的抑菌效果优于S.aureus。综上,Tae4蛋白对金黄色葡萄球菌和产单核细胞李氏杆菌具有抑菌效果,与青霉素联用抑菌效果得到了增强,为后续抗生素替代提供理论依据。 展开更多

关键词 Tae4 Ⅵ型分泌系统 金黄色葡萄球菌 产单核细胞李氏杆菌 抗生素替代

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检测产单核细胞李氏杆菌溶血素的胶体金试纸条制备及初步应用 被引量：4

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作者 江玲丽 高有领 +4 位作者 胡兴娟 章先 杨云凯 魏华 方维焕 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1841-1848,共8页

产单核细胞李氏杆菌为重要的食源性病原菌,本研究旨在建立快速、灵敏、特异的检测方法,提高检测效率和检测通量。李氏杆菌溶血素(LLO)蛋白经原核表达后,制备单克隆抗体,测定单克隆抗体的亚型、效价及亲和力。柠檬酸钠法研制LLO胶体金试... 产单核细胞李氏杆菌为重要的食源性病原菌,本研究旨在建立快速、灵敏、特异的检测方法,提高检测效率和检测通量。李氏杆菌溶血素(LLO)蛋白经原核表达后,制备单克隆抗体,测定单克隆抗体的亚型、效价及亲和力。柠檬酸钠法研制LLO胶体金试纸条,并对试纸条的特异性、敏感性、重复性、稳定性及模拟样品进行检测,并初步应用于实际海产品的检测。结果发现,制备的LLO单克隆抗体特异性强、稳定性高、重复性佳、灵敏度较高,亲和力好,亲和力常数为4.25×10^(8) L·mol^(-1)。人工污染样品试验表明灵敏度与纯细菌培养物基本一致,为3.0×10^(5)CFU·mL^(-1)。将LLO胶体金试纸条应用于500份海产品的实际检测中,产单核细胞李氏杆菌的阳性检出率为2.20%(11/500),略低于国标检测方法(GB4789.30—2010)的2.40%(12/500)和PCR检测方法的2.40%(12/500),三者之间符合率为91.67%。另外缩短检测时间至15 min,检测效率大幅度提高。本研究建立的LLO胶体金检测方法可用于产单核细胞李氏杆菌的快速检测。 展开更多

关键词 产单核细胞李氏杆菌 李氏杆菌溶血素 单克隆抗体 胶体金试纸 海产品初步应用

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应用PCR方法鉴别绵羊产单核细胞李氏杆菌

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作者 蒋建军 剡根强 +2 位作者 王鹏雁 马勋 王静梅 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期33-35,共3页

结合溶血试验和动物试验,应用PCR鉴别新疆5个地区从绵羊实质器官及饲草中分离到的7株李氏杆菌,它们分别是90SB 1、90SB 2、90SB 5、90SS1、125SL 1、G 1和饲草李。试验结果表明,前5株为产单核细胞李氏杆菌。

关键词 PCR 绵羊 产单核细胞李氏杆菌 鉴别

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新疆阿拉尔市绵羊产单核细胞李氏杆菌带菌情况的调查

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作者 吴静 陈瑛 贾桂珍 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2018年第2期50-52,共3页

为了解阿拉尔周边产单核细胞李氏杆菌的带菌情况。从阿拉尔市无菌采集120份羊鼻拭检样,依次进行两步增菌、选择性分离平板分离培养、初筛试验、生化鉴定,通过小鼠感染试验测定致病力。结果从120份样品中分离4株产单核细胞李氏杆菌,带菌... 为了解阿拉尔周边产单核细胞李氏杆菌的带菌情况。从阿拉尔市无菌采集120份羊鼻拭检样,依次进行两步增菌、选择性分离平板分离培养、初筛试验、生化鉴定,通过小鼠感染试验测定致病力。结果从120份样品中分离4株产单核细胞李氏杆菌,带菌率达3.3%。4株LM均引起小鼠发病,其中2株菌可使小鼠死亡。结论阿拉尔周边羊鼻拭中产单核细胞李氏杆菌的带菌率为3.3%,但都有致病性,调查为该地区动物性食品安全评估及产单核细胞李氏杆菌的监测提供参考和科学依据。 展开更多

关键词 绵羊 产单核细胞李氏杆菌 分离鉴定

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李氏杆菌溶血素基因的表达及活性分析 被引量：4

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作者 张杰 骆学农 +3 位作者 郑亚东 李辉 伏小平 朱小玲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期852-855,共4页

根据LMO溶血素基因hlyA设计引物,PCR扩增hlyA,将扩增产物与pMD18-T连接,重组质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序。将由重组质粒pMD18-hlyA上扩增的缺失信号肽序列的目的片段与表达载体DGEX-4T-1分别酶切连接后,转化BL21细胞。筛选... 根据LMO溶血素基因hlyA设计引物,PCR扩增hlyA,将扩增产物与pMD18-T连接,重组质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序。将由重组质粒pMD18-hlyA上扩增的缺失信号肽序列的目的片段与表达载体DGEX-4T-1分别酶切连接后,转化BL21细胞。筛选阳性克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,纯化重组融合蛋白进行溶血试验、小鼠致病力试验和间接ELISA分析。结果表明hlyA基因在大肠杆菌中成功表达分子量82Ku的融合蛋白,能裂解红细胞,且能被LMO阳性血清所识别。一定剂量腹腔注射能将小鼠致死。以此为包被抗原的间接ELISA可以将LMO阴、阳性血清分开。这表明GST-LLO融合蛋白具有良好的生物活性,可用于李氏杆菌病的间接ELISA诊断。 展开更多

关键词 产单核细胞李氏杆菌 表达 活性分析

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奶牛李氏杆菌的分离与鉴定

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作者 李星寓 李丽好 +2 位作者 曹杰 赵德明 尹晓敏 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第5期44-45,I0003,共3页

为确定北京某养牛场送检的出现神经症状的病死奶牛的病原,从病牛的脑组织中分离培养到1株革兰阳性球杆菌。通过细菌形态学观察、PCR鉴定和病理组织学观察,结果均显示该菌呈现产单核细胞李氏杆菌的典型特征,结合临床症状,将其鉴定为产单... 为确定北京某养牛场送检的出现神经症状的病死奶牛的病原,从病牛的脑组织中分离培养到1株革兰阳性球杆菌。通过细菌形态学观察、PCR鉴定和病理组织学观察,结果均显示该菌呈现产单核细胞李氏杆菌的典型特征,结合临床症状,将其鉴定为产单核细胞李氏杆菌。 展开更多

关键词 奶牛 产单核细胞李氏杆菌 分离 鉴定

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1株跨种裂解李氏杆菌噬菌体的分离鉴定 被引量：1

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作者 李天昊 赵学慧 +7 位作者 宋晨 委慧玲 齐玉梅 田常青 祁国军 史文静 苟惠天 薛慧文 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1544-1552,共9页

本研究旨在获得天然李氏杆菌噬菌体,提供防治李氏杆菌病新型生物制剂,减少抗微生物药物的使用,抑制病原菌耐药性的产生。利用产单核细胞李氏杆菌作为宿主菌对屠宰场污水进行双层琼脂平板法筛选,获得噬菌体,并对其进行透射电镜观察、生... 本研究旨在获得天然李氏杆菌噬菌体,提供防治李氏杆菌病新型生物制剂,减少抗微生物药物的使用,抑制病原菌耐药性的产生。利用产单核细胞李氏杆菌作为宿主菌对屠宰场污水进行双层琼脂平板法筛选,获得噬菌体,并对其进行透射电镜观察、生长特性检测(温度、pH、一步生长曲线、最佳感染复数、有机溶剂影响)、基因组酶切鉴定和全基因组测序分析。分离出的产单核细胞李氏杆菌噬菌体中,选取1株裂解性强,遗传稳定的噬菌体进行后续试验,并命名为LP8;经电镜观察为肌尾科噬菌体,可以跨种裂解18株产单核细胞李氏杆菌和5株威尔斯李氏杆菌,确定LP8的最佳感染复数为1、最适生长温度为45℃、最适pH为7;在6种有机溶剂中,仅异戊醇可导致LP8活性丧失;对提取的基因组进行酶切鉴定,确定为双链DNA;LP8全基因组测序结果表明,基因组大小为87038 bp、含有120个编码基因、编码基因的累计长度为76326 bp、编码基因的平均长度为636 bp、编码区域长度占基因组的比例为87.69%。本试验分离出产单核细胞李氏杆菌噬菌体,并对其噬菌能力和应用价值进行鉴定。分离出的LP8噬菌体相较于李氏杆菌的噬菌体,细菌裂解能力更强,适应环境范围更广。本研究为实验室后续建立产单核细胞李氏杆菌噬菌体库和产单核细胞李氏杆菌噬菌体的其他应用提供了良好的基础。 展开更多

关键词 产单核细胞李氏杆菌 噬菌体 分离 鉴定

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猪李氏杆菌病的诊治体会 被引量：1

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作者 闫隆飞 《山东畜牧兽医》 2020年第12期28-29,共2页

猪李氏杆菌病主要是由产单核细胞李氏杆菌引起的人、家畜、禽类以及啮齿动物共患的一种散发性传染病。猪表现为以脑膜炎、败血症和单核细胞增多症、妊娠母猪发生流产为特征的传染病。病原李氏杆菌在自然界分布很广而且能长期生存,在尸... 猪李氏杆菌病主要是由产单核细胞李氏杆菌引起的人、家畜、禽类以及啮齿动物共患的一种散发性传染病。猪表现为以脑膜炎、败血症和单核细胞增多症、妊娠母猪发生流产为特征的传染病。病原李氏杆菌在自然界分布很广而且能长期生存,在尸体中可存活4~8个月。2%的火碱、10%的石灰乳能在10 min内杀死杆菌。本病多发于早春、秋、冬或气候突变的时节,常呈散发或地方性流行。不同年龄的猪都可感染,但仔猪最易感。传染主要通过粪、口途径发生。 展开更多

关键词 猪李氏杆菌病 单核细胞增多症 妊娠母猪 产单核细胞李氏杆菌 啮齿动物 气候突变 脑膜炎 败血症

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3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：13

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作者 王华健 张宁 +7 位作者 杨威 赵志强 李茜 陆安 田勇 何欣 赵兴华 李杰峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期1201-1209,共9页

旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157∶H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法。针对大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异... 旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157∶H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法。针对大肠杆菌O157∶H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行特异性、灵敏性和重复性试验,应用建立的方法检测生鲜食品中致病菌并与国家标准方法对比。结果显示:建立的多重qPCR方法特异性好,只扩增3种靶细菌;灵敏性最低检测值均为10^(4) copies·μL^(-1);重复性良好,批内变异系数为0.09%~2.97%,批间变异系数为0.23%~7.82%;对120份生鲜肉样品进行检测对比,两种方法均检出2份大肠杆菌O157∶H7,21份产单核细胞李氏杆菌,多重qPCR方法检出14份沙门菌,比国标法多检出1份,建立的方法可检出所有受污染样品。综上表明,建立的多重qPCR检测方法能快速、准确检测食品中大肠杆菌O157∶H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌,为食品安全提供技术保障。 展开更多

关键词 食源性致病菌 多重荧光定量PCR 检测方法 大肠杆菌O157∶H7 沙门菌 产单核细胞李氏杆菌

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