单核苷酸多态性相关的拷贝数变异(copy number variant, CNV)在体外诊断和精准治疗中占据着重要地位,而其常用的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)无法区分具有单核苷酸差异的CNV。本研究利用交叉活性探针定...单核苷酸多态性相关的拷贝数变异(copy number variant, CNV)在体外诊断和精准治疗中占据着重要地位,而其常用的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)无法区分具有单核苷酸差异的CNV。本研究利用交叉活性探针定性与定量检测具有单核苷酸差异的拷贝数变异(copy number variant, CNV)。rs76711854所在以及下游9 514 bp长度片段通过PCR方法扩增获得,其基因型通过一代测序确认。此SNP的定性与定量分别通过探针法的定量PCR和数字PCR方法检测。rs76711854所在的CNV在针对G基因型探针出现分层,并在针对GA不同基因型的探针中均表现出A/G比例2:1。检测长度超过其下游9 kb以及更长的92 kb和203 kb的DNA片段,发现此CNV存在于前列腺癌细胞系DU145中,而子宫内膜癌细胞系中此203 kb范围拷贝数一致。本研究开发出以rs76711854位点的G/A片段为例,通过不同通道交叉定量检测的CNV方法,并推断DU145细胞的此处为多拷贝。展开更多
数字PCR(digital PCR,dPCR)相比传统定量PCR具有多种优势,然而,其终点法的思路及单分子扩增体系需要对实验进行更细致的优化。数字PCR最低出版规范(the Minimum Information for the Publication of Digital PCR Experiments,d MIQE)提...数字PCR(digital PCR,dPCR)相比传统定量PCR具有多种优势,然而,其终点法的思路及单分子扩增体系需要对实验进行更细致的优化。数字PCR最低出版规范(the Minimum Information for the Publication of Digital PCR Experiments,d MIQE)提出了优化思路。然而,大多数发表的论文没有实现dMIQE的优化思路。本研究拟将利用探针的交叉扩增活性来实现数字PCR的优化。痕量DNA模板的检测以及定量是分子生物学中的重要应用之一。以结肠癌相关转录因子2(colon cancer correlation transcription factor 2,CCAT2)基因的G/T片段来模拟痕量核酸,并以梯度浓度的模板作为内参照来指示非特异扩增,进行微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。首先,以qPCR方法确认探针的交叉扩增活性,并通过梯度PCR方法确认最佳区分温度(59℃),用于随后的实验。在梯度模板对照指引下,针对非特异扩增做出设置。本研究通过应用具有交叉扩增活性的TaqMan~探针,以微滴式数字PCR技术,在不同通道以高低活性交叉确定痕量的PCR模板(T片段为6.8 copies/μL;G片段为4.2 copies/μL;总量为11 copies/μL),实现了交叉验证。本研究提出的以高低活性的扩增实现互相验证的策略,可以作为dMIQE的优化方案,并提高ddPCR的可信度。展开更多
文摘数字PCR(digital PCR,dPCR)相比传统定量PCR具有多种优势,然而,其终点法的思路及单分子扩增体系需要对实验进行更细致的优化。数字PCR最低出版规范(the Minimum Information for the Publication of Digital PCR Experiments,d MIQE)提出了优化思路。然而,大多数发表的论文没有实现dMIQE的优化思路。本研究拟将利用探针的交叉扩增活性来实现数字PCR的优化。痕量DNA模板的检测以及定量是分子生物学中的重要应用之一。以结肠癌相关转录因子2(colon cancer correlation transcription factor 2,CCAT2)基因的G/T片段来模拟痕量核酸,并以梯度浓度的模板作为内参照来指示非特异扩增,进行微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。首先,以qPCR方法确认探针的交叉扩增活性,并通过梯度PCR方法确认最佳区分温度(59℃),用于随后的实验。在梯度模板对照指引下,针对非特异扩增做出设置。本研究通过应用具有交叉扩增活性的TaqMan~探针,以微滴式数字PCR技术,在不同通道以高低活性交叉确定痕量的PCR模板(T片段为6.8 copies/μL;G片段为4.2 copies/μL;总量为11 copies/μL),实现了交叉验证。本研究提出的以高低活性的扩增实现互相验证的策略,可以作为dMIQE的优化方案,并提高ddPCR的可信度。
