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鸡毒支原体弱毒F株与强毒株二重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立 被引量：5
1
作者 罗思思 谢芝勋 +5 位作者 邓显文 谢丽基 谢志勤 庞耀珊 刘加波 范晴 《中国家禽》 北大核心 2012年第18期20-24,共5页
研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道... 研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 二重荧光pcr 鉴别检测
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布氏杆菌和结核杆菌二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用 被引量：17
2
作者 孟茹 陈创夫 +4 位作者 张辉 乔军 任艳 王正荣 蒋松 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1012-1017,共6页
本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性... 本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布氏杆菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布氏杆菌Tm值为88～89℃,结核杆菌Tm值为90～91℃,对其他供试的菌株则为阴性;该方法对布氏杆菌的DNA最低检出量为20拷贝.μL-1,结核杆菌为50拷贝.μL-1,两病原都存在时为100拷贝.μL-1,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对24份结核痰样、11份布氏杆菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。本试验建立的方法可用于同时检测布氏杆菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。 展开更多
关键词 布氏杆菌 结核杆菌 二重实时荧光定量pcr
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贝类派琴虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立 被引量：3
3
作者 谢芝勋 谢丽基 +3 位作者 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期898-904,共7页
根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对派琴虫和折光马尔太... 根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;对派琴虫和折光马尔太虫不同浓度模板进行组合,该方法仍可有效地同时检测出这二种原虫。研究建立的派琴虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。 展开更多
关键词 派琴虫 折光马尔太虫 二重荧光定量pcr
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贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立 被引量：3
4
作者 谢丽基 谢芝勋 +3 位作者 庞耀珊 刘加波 邓显文 谢志勤 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2010年第3期77-83,共7页
根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马... 根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。 展开更多
关键词 单孢子虫 折光马尔太虫 二重荧光定量pcr
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鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：13
5
作者 许宗丽 谢芝勋 +5 位作者 谢丽基 刘加波 谢志勤 庞耀珊 邓显文 范晴 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第4期26-31,共6页
根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和... 根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。 展开更多
关键词 鸭副黏病毒 鸭圆环病毒 二重荧光定量pcr
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转基因大豆及其制品二重荧光定量PCR的建立与验证 被引量：3
6
作者 王凤军 叶素丹 +1 位作者 陈冠武 包永华 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期236-239,271,共5页
研究选用花椰菜花叶病毒35S启动子(P-35S)和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(T-NOS)为靶标基因,运用多重实时荧光PCR技术对转基因大豆及其制品进行快速筛选检测。实验通过样品核酸提取与质控,多重引物及荧光探针的设计与筛选,反应条... 研究选用花椰菜花叶病毒35S启动子(P-35S)和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(T-NOS)为靶标基因,运用多重实时荧光PCR技术对转基因大豆及其制品进行快速筛选检测。实验通过样品核酸提取与质控,多重引物及荧光探针的设计与筛选,反应条件和反应体系的对比优化,摸索出二重荧光定量PCR检测的最佳反应体系。同时通过特异性、重复性、灵敏性和适用性实验验证,确保了该方法在同时检测2个靶标基因时,无荧光信号的相互干扰,不会出现假阴性和假阳性结果。结果表明,方法特异性高,可同时筛查两个靶标基因,扩增效率在90%~110%之间,标准曲线决定系数R2>0.98,确定了最低检测限为2拷贝/μL。开发和建立的二重荧光定量PCR检测技术可以实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进食品进出口提供技术保障。 展开更多
关键词 转基因大豆 二重实时荧光pcr 快速筛选检测 深加工制品
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鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：3
7
作者 孔刚锐 吴志明 +7 位作者 闫若潜 赵明军 王东方 赵雪丽 闫志玲 程俊贞 陈慧娟 靳利粉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第12期27-33,共7页
据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条... 据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV)的非结构蛋白2(Nsp2)基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR(Real-time fluorescent quantitative RTPCR)检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LPPRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达101拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。 展开更多
关键词 高 低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重实时荧光定量RT—pcr TAQMAN MGB荧光探针 检测 应用
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罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：3
8
作者 黄玉英 杨明伟 +5 位作者 谭红连 梁正 曾兰 韦信贤 黄光华 童桂香 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1474-1482,共9页
【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因... 【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)和十足目虹彩病毒1(DIV1)的二重荧光定量PCR,为罗氏沼虾白尾病(WTD)及虹彩病毒病(DIV1D)的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的基因片段分别克隆至pGM-T载体上制备重组质粒(pGM-T-CP^(MrNV)和pGM-T-MCP^(DIV1)),其中,pGM-T-CP^(MrNV)用Sal I酶切后经体外转录获得MrNV标准品RNA,pGM-T-MCP^(DIV1)则直接作为DIV1标准品DNA;以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定,建立可同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性,可作为标准品和阳性对照使用;标准品起始模板范围为1.0×10^(1)~1.0×10^(8)Copies/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的二重荧光定量PCR灵敏度高,对标准品的检测灵敏度可达10 Copies/反应,对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10 Copies/mg;与其他虾类常见病原无交叉反应,且整个检测过程仅需1 h左右。二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31%~0.93%和0.96%~1.33%,检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35%~0.81%和0.78%~1.04%。应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份临床样品进行MrNV和DIV1检测,结果显示对MrNV和DIV1检测的符合率分别为99.15%和97.44%,且二重荧光定量PCR检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR具有更高的灵敏度。2020年广西罗氏沼虾样品MrNV和DIV1的阳性检出率分别为6.0%和11.0%。【结论】结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1,且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点,可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障。 展开更多
关键词 罗氏沼虾野田村病毒(MrNV) 十足目虹彩病毒1(DIV1) TAQMAN-MGB探针 二重荧光定量pcr
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贝类包拉米虫和派琴虫二重荧光定量PCR方法的建立
9
作者 张艳芳 谢芝勋 +6 位作者 谢丽基 刘加波 庞耀珊 范晴 罗思思 邓显文 谢志勤 《中国动物检疫》 CAS 2013年第5期49-53,共5页
根据GenBank中包拉米虫和派琴虫保守基因序列,用Primer Express3.0软件设计合成了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对包拉米虫和派琴虫的检... 根据GenBank中包拉米虫和派琴虫保守基因序列,用Primer Express3.0软件设计合成了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对包拉米虫和派琴虫的检测敏感性达到200个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对包拉米虫和派琴虫不同模板浓度进行组合,仍可有效同时检测到这两个原虫。该方法对单孢子虫、马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的包拉米虫和派琴虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类包拉米虫和派琴虫感染的检测。 展开更多
关键词 包拉米虫 派琴虫 二重实时荧光定量pcr
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