SB转座子介导的hLF乳腺表达载体的构建及鉴定

1

作者 宋洋 王子玉 +7 位作者 张艳丽 钟部帅 张国敏 孟立 黄荣 王昌龙 闫益波 王锋 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第4期795-801,共7页

构建了以睡美人(Sleeping beauty,SB)转座子为载体元件、β-乳球蛋白质(β-lactoglobulin,BLG)为调控区的人乳铁蛋白质(Human lactoferrin,hLF)乳腺表达载体及增强型绿色荧光蛋白质(EGFP)表达载体,便于验证SB转座子的转座效率,为hLF乳... 构建了以睡美人(Sleeping beauty,SB)转座子为载体元件、β-乳球蛋白质(β-lactoglobulin,BLG)为调控区的人乳铁蛋白质(Human lactoferrin,hLF)乳腺表达载体及增强型绿色荧光蛋白质(EGFP)表达载体,便于验证SB转座子的转座效率,为hLF乳腺表达载体成功转染乳腺上皮细胞(GMC)奠定基础。采用PCR法从绵羊基因组中扩增5'、3'BLG,经TA克隆,在中间载体pcDNA3.1(-)的作用下,与hLF连接,得到pcDNA3.1(-)-BLG-hLF,然后与pT2连接,构建pT2-BLG-hLF;此外,还构建了pT2-BLG-EGFP。采用测序、酶切、PCR 3种方法鉴定阳性克隆,并用脂质体法将pT2-BLG-EGFP转染至GMC细胞中进行观察。分子鉴定结果:5'BLG、3'BLG克隆成功,pT2-BLG-hLF及pT2-BLG-EGFP构建正确;细胞鉴定结果:SB转座子介导的EGFP能在GMC细胞中高效表达。成功克隆了5'BLG、3'BLG调控区,并成功构建了乳腺表达载体pT2-BLG-hLF。 展开更多

关键词 “睡美人”(SB)转座子 Β-乳球蛋白 乳腺表达载体 乳腺上皮细胞

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乳腺定位表达载体在小鼠乳腺中的活性检测

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作者 黄伟民 赖良学 +6 位作者 乔桂林 岳军明 安靓 王凯 付殿国 殷震 李进 《第一军医大学学报》 CSCD 2000年第5期397-398,共2页

目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白(人组织型纤溶酶原激活剂（WAP-tPA）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中，待小鼠产子、泌乳后，检测出小鼠乳汁中tPA的表达量为80 n... 目的 检测乳腺定位表达载体在动物乳腺中的表达活力。方法与结果 将乳腺定位表达载体乳清酸蛋白(人组织型纤溶酶原激活剂（WAP-tPA）通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中，待小鼠产子、泌乳后，检测出小鼠乳汁中tPA的表达量为80 ng/ml。结论 此方法可以作为从动物整体水平上检测乳腺定位表达载体表达效力的一种简便而有效的方法。 展开更多

关键词 基因转染 乳腺 乳腺定位表达载体 小鼠 WAP-tPA

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奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定

3

作者 曹随忠 姚学萍 +4 位作者 崔亚飞 杨德英 雍康 余树民 刘宗平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第6期1-7,18,共8页

【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP... 【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。 展开更多

关键词 奶牛 乳房炎 Β-防御素 气管抗菌肽基因 乳腺特异性表达载体

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乳腺特异表达载体缺失片段的鉴定与修复

4

作者 房希碧 刘晶 +2 位作者 刘一诺 卢春燕 赵志辉 《青岛农业大学学报（自然科学版）》 2010年第3期228-231,共4页

通过对pBC1中的乳腺特异表达启动子成分进行分析,鉴定了位于β酪蛋白启动子上游两个EcoRⅠ位点(-89^-94和-120^-125)之间的缺失片段,31bp的缺失使得该载体中的一个乳控盒元件(-112^-141)和一个乳腺因子识别序列(-92^-102)遭到破坏,并使... 通过对pBC1中的乳腺特异表达启动子成分进行分析,鉴定了位于β酪蛋白启动子上游两个EcoRⅠ位点(-89^-94和-120^-125)之间的缺失片段,31bp的缺失使得该载体中的一个乳控盒元件(-112^-141)和一个乳腺因子识别序列(-92^-102)遭到破坏,并使得位于TATA框上游的所有启动子成分发生了位置改变。通过与山羊β酪蛋白启动子序列进行比较,设计并合成了缺失片段,经一系列的酶切和连接处理,使得该缺失得到了修复,修复后的载体具有所有乳蛋白表达需要的启动子调控原件。本试验结果为利用修复后的乳腺特异高效表达载体进行乳腺生物反应器的研究奠定了分子生物学基础。 展开更多

关键词 乳腺特异表达载体 β酪蛋白 启动子 修复

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转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

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作者 王春生 李咏乐 +2 位作者 仇雨歌 朴善花 安铁洙 《安徽农业科学》 CAS 2014年第24期8099-8101,8166,共4页

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法。[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞。[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞... [目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法。[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞。[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度(400μg/ml)筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的"S";转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中。[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株。 展开更多

关键词 山羊 乳腺特异表达载体 BRAZZEIN基因 转基因细胞

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奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体构建

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作者 董克家 钱建新 《海南医学院学报》 CAS 2003年第6期323-324,共2页

目的:构建奶水牛乳腺表达人FSHβ基因载体。方法:利用限制性内切酶和T4DNA连接酶方法将转基因构件(水牛β酪蛋白启动子、hFSHβ、SV40PolyA)插入pLXIN载体中,通过转化大肠杆菌,筛选阳性克隆。结果:通过酶切鉴定及测序分析表明pLXIN插入... 目的:构建奶水牛乳腺表达人FSHβ基因载体。方法:利用限制性内切酶和T4DNA连接酶方法将转基因构件(水牛β酪蛋白启动子、hFSHβ、SV40PolyA)插入pLXIN载体中,通过转化大肠杆菌,筛选阳性克隆。结果:通过酶切鉴定及测序分析表明pLXIN插入转基因构件。结论:奶水牛乳腺表达人FSHβ基因的载体为:pLXIN-hFSHβ。 展开更多

关键词 水牛 乳腺定位表达载体 人卵泡刺激素

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猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建 被引量：1

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作者 黎丽荣 黄海军 +7 位作者 高其双 董斌科 邓兵 刘艳 陶弼菲 向敏 吴建英 蒋思文 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期127-129,134,共4页

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和... 为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定。结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础。 展开更多

关键词 猪β防御素1 山羊乳球蛋白 乳腺特异性表达载体 抗菌机理

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奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定 被引量：1

8

作者 张志鹏 江静宜 +3 位作者 夏海磊 冀德君 李明勋 杨章平 《家畜生态学报》 北大核心 2019年第5期24-28,共5页

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳... 研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经AseI+HindIII双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光,HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 展开更多

关键词 奶牛乳房炎 溶菌酶 乳腺特异性表达载体 基因治疗

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猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点片段的真核表达 被引量：1

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作者 吕宁 彭树英 张涌 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第4期26-28,共3页

为探讨利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因疫苗的可行性,构建了以奶牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白为报告基因的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因抗原位点区乳腺表达载体pEGBS。通过脂质体介导方法将其转染小鼠乳腺... 为探讨利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因疫苗的可行性,构建了以奶牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白为报告基因的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因抗原位点区乳腺表达载体pEGBS。通过脂质体介导方法将其转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,在倒置荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光分布于阳性细胞,并且RT-PCR检测结果显示,RT-PCR扩增产物与目的基因片段大小相符,证明其确实源于重组质粒转录后的mRNA。 展开更多

关键词 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 乳腺表达载体 小鼠乳腺癌细胞

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人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立 被引量：3

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作者 岳军明 张宏权 +6 位作者 李宝林 户荣良 俞炜源 王会信 殷震 李华 王太一 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第2期140-143,共4页

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核，从注射的３００枚受精卵中，１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中，经ＰＣ... 应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核，从注射的３００枚受精卵中，１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实，有３只转基因阳性的小鼠． 展开更多

关键词 乳腺定位表达载体 转基因 人尿激酶原cDNA

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转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的研究 被引量：7

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作者 郑月茂 刘凤军 +1 位作者 何小宁 张涌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1282-1286,共5页

利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因的重组质粒,并导入到山羊乳腺上皮细胞,经G418及PCR筛选获得阳性细胞;转染细胞增殖后经激素诱导,培养液上清通过Western blot检测证明,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白,其分子质量为58 ku。

关键词 人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体 绿色荧光蛋白 转基因山羊乳腺上皮细胞

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郑州大学学报(医学版)双月刊1957年创刊第39卷总目次

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《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第6期i001-i009,共9页

关键词 治疗体会 患者 疗效观察 蛋白 李建生 大鼠脑 乔玉环 临床观察 内皮素 细胞凋亡 乳腺特异性表达载体 肾母细胞瘤 杜氏盐藻 食管癌 食管肿瘤 食管鳞癌 夜遗尿 学报 连续出版物 医学 现代医药学 目次

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