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非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型PCR-RFLP鉴别方法的建立
1
作者 孙仁杰 徐慧玲 +6 位作者 孙思琪 柴娟 虞一聪 谢荣辉 李肖梁 赵灵燕 张传亮 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第5期1017-1028,共12页
本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的PCR-RFLP鉴别方法。通过对ASFV基因Ⅰ型与基因Ⅱ型基因组序列的比对分析,针对B385R基因和B125R基因保守区设计1对特异性PCR-RFLP引物,与其他临床上常... 本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因Ⅰ型和Ⅱ型的PCR-RFLP鉴别方法。通过对ASFV基因Ⅰ型与基因Ⅱ型基因组序列的比对分析,针对B385R基因和B125R基因保守区设计1对特异性PCR-RFLP引物,与其他临床上常见的9种猪病病毒均无交叉反应。通过该引物扩增获得覆盖B646L基因全长的DNA片段作为检测靶标,结合BmgBⅠ酶切进行RFLP图谱分析,即可实现对B646L基因全序列的快速检测,有效区分ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型,最低检测DNA质量浓度可达到5 pg·mL^(-1)。模拟临床样本的研究结果表明,本方法还能够有效应对实际检测中基因Ⅰ型和Ⅱ型的混合感染。综上,本方法操作简便、准确性高、特异性强、灵敏度高、成本较低,具有良好的应用前景,为基层兽医技术人员开展非洲猪瘟疫情的监测和流行病学研究提供了一种新方法。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性 基因ⅰ型 基因Ⅱ型
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日本脑炎病毒逃逸Ⅰ型干扰素机制在小鼠感染模型创制中的应用进展
2
作者 周轶凡 张彩勤 +3 位作者 李秉润 包娇娇 张延英 师长宏 《中国实验动物学报》 北大核心 2025年第2期288-295,共8页
日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染人体后首先会逃避先天免疫的Ⅰ型干扰素(Ⅰ-interferon,Ⅰ-IFN)的抑制作用,进而感染其他细胞和组织,引起痉挛、神经退行性病变和神经性炎症等系列严重症状甚至死亡。JEV主要通过抑制... 日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染人体后首先会逃避先天免疫的Ⅰ型干扰素(Ⅰ-interferon,Ⅰ-IFN)的抑制作用,进而感染其他细胞和组织,引起痉挛、神经退行性病变和神经性炎症等系列严重症状甚至死亡。JEV主要通过抑制IFN-α/β产生和干扰素的Janus激酶(Janus kinase, Jak)-信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription, STAT)信号通路来逃逸先天免疫,基于JEV的免疫逃逸机制构建了多种小鼠感染模型,用于研究JEV感染的致病机制和治疗方案。本文在阐述JEV的干扰素(interferon, IFN)免疫逃逸机制的基础上,系统介绍了相应的小鼠感染模型,分析该类小鼠模型的特点、人类症状的模拟程度等,基于此可能发现新的研究靶点,进而开发新的JEV感染小鼠模型,为JEV研究提供理想的动物模型。 展开更多
关键词 日本脑炎病毒 ⅰ型干扰素 免疫逃逸 小鼠模型
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中国首次分离的二株基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒全基因组序列分析（英文） 被引量：5
3
作者 冯云 李灿委 +2 位作者 章域震 杨卫红 张海林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期829-835,共7页
目的分析中国首次分离的基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV)全基因组的基因组特征。方法设计JEV全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片断,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。采用生物学软件进行同源性和系统进化分析。结果 1977和1982年... 目的分析中国首次分离的基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV)全基因组的基因组特征。方法设计JEV全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片断,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。采用生物学软件进行同源性和系统进化分析。结果 1977和1982年分离自云南蚊虫的M28和BN82215病毒株基因组全长分别为10 969bp和10 970bp,5′非编码区均含有96个核苷酸,3′非编码区含有573和574个核苷酸。它们的开放阅读框(ORF)都从97到10 396位,共10 299个核苷酸,编码3 433个氨基酸。M28和BN82215株与来自GenBank的5个基因型JEV株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4%~96.3%和91.4%~99.6%,与近几年国内外基因Ⅰ型流行株的同源性最高,进化关系最接近,都属于基因Ⅰ型。这两株病毒与JEV疫苗株SA14-14-2相比,有56个氨基酸差异,其中E基因有11个氨基酸差异,但都不属抗原关键位点。结论本研究阐明了中国首次分离的基因Ⅰ型JEV的全基因组分子特征,决定病毒抗原和毒力的E蛋白关键位点无明显变化。证实20世纪70和80年代云南省就有基因Ⅰ型JEV流行。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎病毒 基因ⅰ型 全基因组 同源性分析 系统进化分析
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湖南地区Ⅰ型乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因序列分析 被引量：1
4
作者 向卫军 杨涛涛 +1 位作者 李润成 余兴龙 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期195-199,共5页
为探寻湖南汨罗地区猪场蚊子携带乙型脑炎病毒(JEV)的情况,对该地区3个猪场蚊子开展JEV的病原学调查研究。从该地区3个种猪场采集约3 900只蚊子,用RT–PCR方法扩增JEV NS5基因,结果从40份样品中检出17份样品呈阳性。将阳性样品研磨液接... 为探寻湖南汨罗地区猪场蚊子携带乙型脑炎病毒(JEV)的情况,对该地区3个猪场蚊子开展JEV的病原学调查研究。从该地区3个种猪场采集约3 900只蚊子,用RT–PCR方法扩增JEV NS5基因,结果从40份样品中检出17份样品呈阳性。将阳性样品研磨液接种BHK–21细胞分离病毒,经3次传代后获得了1株JEV,将新分离株命名为HNML1株。根据JEV的E基因序列设计1对引物,用RT–PCR方法扩增HNML1株的E基因,并进行序列测定和同源性分析,结果表明,该E基因的核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相应序列的同源性为86.9%;该E基因的氨基酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相应序列的同源性为97.0%,二者存在15个氨基酸的差异(其中包括8个与关键毒力相关的氨基酸)。基因同源性分析结果表明,HNML1株为基因Ⅰ型JEV毒株。 展开更多
关键词 猪场 蚊子 基因I型 乙型脑炎病毒 湖南汨罗
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ASFV基因Ⅰ/Ⅱ型重组毒株与基因Ⅰ型、Ⅱ型高毒力毒株的致病力试验数据比较
5
作者 戈胜强 左媛媛 +5 位作者 常星 巩明霞 刘春菊 于小静 李金明 王志亮 《中国动物检疫》 2025年第8期72-77,共6页
非洲猪瘟病毒(ASFV)按其毒力分为高毒力、中毒力和低毒力三类。我国现有两类高毒力毒株,分别为2018年传入的基因II型毒株和2021年出现的基因Ⅲ型重组毒株。2023年越南和俄罗斯均发现了基因Ⅰ/Ⅱ型重组病毒,且其全基因组序列与中国分离... 非洲猪瘟病毒(ASFV)按其毒力分为高毒力、中毒力和低毒力三类。我国现有两类高毒力毒株,分别为2018年传入的基因II型毒株和2021年出现的基因Ⅲ型重组毒株。2023年越南和俄罗斯均发现了基因Ⅰ/Ⅱ型重组病毒,且其全基因组序列与中国分离株高度相似。为研究基因Ⅰ/Ⅱ型重组病毒的毒力水平,汇总了中国、越南和俄罗斯开展的重组病毒动物试验数据,并与基因Ⅰ型、Ⅱ型高毒力毒株进行致病力比较。结果显示同等攻毒剂量下,重组病毒导致的死亡起始或终止时间更早,提示其毒力可能更强。本文为非洲猪瘟相关研究和防控提供了参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 基因ⅰ/Ⅱ型重组毒株 高毒力毒株
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1株猪源基因Ⅰ型乙型脑炎病毒的分离鉴定及遗传进化分析 被引量：1
6
作者 侯力丹 王文涛 +1 位作者 曹胜波 黄少梅 《养殖与饲料》 2016年第9期4-9,共6页
乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的急性、自然疫源性蚊媒传播人兽共患传染病。猪是JEV最重要的宿主,监测和预防猪乙脑的发生对于人乙脑的防控具有重要意义。本研究通过RT-PCR、细胞接种、乳鼠脑内接种、电镜观察等方法,从广西某猪场... 乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒引起的急性、自然疫源性蚊媒传播人兽共患传染病。猪是JEV最重要的宿主,监测和预防猪乙脑的发生对于人乙脑的防控具有重要意义。本研究通过RT-PCR、细胞接种、乳鼠脑内接种、电镜观察等方法,从广西某猪场的猪脑组织样品中分离了1株乙型脑炎病毒,命名为GX1209。全基因组测序结果表明,该毒株基因组为10 965 bp。系统进化分析表明该毒株属基因Ⅰ型,与基因Ⅰ型XJ69毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,达到99%,而与SA14、SA14-14-2、P3等Ⅲ型毒株的氨基酸同源性分别为98%、97%、98%。 展开更多
关键词 猪乙型脑炎病毒 基因型 分离鉴定 遗传进化
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上海地区鸽Ⅰ型副黏病毒F基因遗传进化及生物信息学分析
7
作者 刘健 周锦萍 +6 位作者 沈莉萍 桂亚萍 葛菲菲 王晓旭 杨显超 刘佩红 王建 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5150-5161,共12页
【目的】了解上海地区鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)流行毒株F基因遗传变异情况,分析F蛋白生物信息学特征,为PPMV-1的防控提供技术支持。【方法】应用RT-PCR方法扩增分离株F基因,测序并进行遗传进化分析,并通过生物信息学在线软件对F蛋白结构... 【目的】了解上海地区鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)流行毒株F基因遗传变异情况,分析F蛋白生物信息学特征,为PPMV-1的防控提供技术支持。【方法】应用RT-PCR方法扩增分离株F基因,测序并进行遗传进化分析,并通过生物信息学在线软件对F蛋白结构功能进行预测分析。【结果】分离株F基因编码区全长为1662 bp,编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株序列结构特征。系统进化树分析结果显示,分离株属于新城疫病毒(NDV)ClassⅡ群Ⅵ.2.1.1.2.2亚型,与疫苗株La Sota和Mukteswar处于不同进化分支,与国内分离株Pi/SH/CH/0617/2013和pigeon/Ningxia/2068/2016同属Ⅵ.2.1.1.2.2分支。生物信息学分析结果表明,F蛋白为亲水性蛋白,分子质量约为59.03 ku,理论等电点(PI)为7.87,半衰期为30 h,不稳定系数为35.06,脂肪系数为109.73。F蛋白主要分布在细胞质膜和内质网中,具有跨膜结构和信号肽,包含6个潜在的N-糖基化位点、13个半胱氨酸残基、103个O-糖基化位点,以及67个磷酸化位点。二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链、β-转角分别占46.11%、31.46%、18.08%及4.34%,三级结构预测结果与二级结构相一致。B细胞抗原位点预测结果显示,F蛋白含有11个抗原表位(氨基酸数目≥7)。【结论】本研究分离获得的PPMV-1分离株属于NDV ClassⅡ群Ⅵ.2.1.1.2.2亚型,其F蛋白具有较好的抗原表位,可作为PPMV-1疫苗研制和抗病毒治疗的靶蛋白。研究结果为有效防控PPMV-1感染提供了一定的参考依据,同时也为进一步研发新型疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 鸽ⅰ型副黏病毒 F基因 遗传进化 生物信息学
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鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及遗传进化分析
8
作者 安乐乐 刘倩芸 +2 位作者 蓝秋菊 罗迅 赵永清 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期167-177,共11页
【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病... 【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。 展开更多
关键词 鸽腺病毒ⅰ型 Hexon基因 TaqMan探针实时荧光定量PCR 遗传进化分析 临床检测 流行病学调查
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乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建 被引量：12
9
作者 徐高原 王祥 +4 位作者 陈焕春 徐晓娟 李自力 何启盖 吴斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期192-197,共6页
设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中,获得重组中间转移质粒pUSK NS1。将pUSK NS1与伪狂犬病毒Ea株TK /gG /LacZ+突变株基因组共转染真核细胞IBRS 2,通过空斑纯化得到了... 设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中,获得重组中间转移质粒pUSK NS1。将pUSK NS1与伪狂犬病毒Ea株TK /gG /LacZ+突变株基因组共转染真核细胞IBRS 2,通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK /gG /NS1+。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 NS1基因重组 伪狂犬病毒 中间转移载体
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乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究 被引量：9
10
作者 汤德元 王凤 +5 位作者 马萍 罗险峰 李春燕 曾智勇 徐健 刘建 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1330-1336,共7页
收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计... 收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因,并将E基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-E,经双酶切鉴定、测序及序列分析鉴定后,再将E基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建乙脑病毒E基因原核表达质粒pET-32a-E,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,得到了约59ku条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白,并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠,免疫后采血检测抗体。结果显示:乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为乙型脑炎亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 贵州分离株 E基因 原核表达 免疫原性
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猪乙型脑炎病毒SH0601株基因组序列分析及全长cDNA的构建 被引量：8
11
作者 郑浩 余丹丹 +2 位作者 孙志 高飞 袁世山 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期140-145,共6页
目的对猪源乙型脑炎病毒SH0601株进行全序列测定与分析,以了解该株病毒的遗传特征,并构建全长cDNA克隆。方法将猪源JEV SH0601株基因组RNA分5段进行RT-PCR并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO和pBluescript载体中,测定了全长cDNA序列。根据cDNA克... 目的对猪源乙型脑炎病毒SH0601株进行全序列测定与分析,以了解该株病毒的遗传特征,并构建全长cDNA克隆。方法将猪源JEV SH0601株基因组RNA分5段进行RT-PCR并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO和pBluescript载体中,测定了全长cDNA序列。根据cDNA克隆酶切图谱分析,将5个片段先后克隆入pBluescript中构建JEV全长基因组cDNA。根据E蛋白基因序列对SH0601株进行了遗传分型。结果序列分析表明:SH0601株基因组全长10977nt,与GenBank中的Beijing-1、P3、SA14和SA14-14-2株基因组全长相比,在3′NTR的10701nt处多一碱基"G",与上述4株病毒的全长核苷酸的同源率都达97.2%以上,而与国外猪源分离株KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002全长核苷酸的同源率仅达88.7%,但SH0601株与6株病毒的全长氨基酸同源率均达97.0%以上。以E蛋白基因序列对SH0601作进化分析,该分离株属基因型Ⅲ型。结论SH0601株属于乙型脑炎病毒基因Ⅲ型。在高拷贝质粒pBluescript中可构建稳定的乙型脑炎病毒全长cDNA克隆。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 病毒基因组 全长CDNA克隆
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猪伪狂犬病、猪细小病毒病和猪流行性乙型脑炎检测基因芯片的制备及检测方法研究 被引量：16
12
作者 张焕容 曹三杰 +1 位作者 文心田 肖驰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期796-801,共6页
对猪伪狂犬病(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒病(Porcine parvovirus,PPV)和猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)检测基因芯片的制备及该芯片的检测方法进行了研究。试验克隆和鉴定了16个芯片靶基因,经筛选,取其... 对猪伪狂犬病(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒病(Porcine parvovirus,PPV)和猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)检测基因芯片的制备及该芯片的检测方法进行了研究。试验克隆和鉴定了16个芯片靶基因,经筛选,取其中13个靶基因PRV gB、gG、TK和gE;PPV NS2、NS3、VP1和VP2以及JEV C、PrM/M、E、NS1和NS5制备PRV、PPV和JEV检测基因芯片,基因芯片点样系统SpotArrayTM 24将靶基因点样于氨基化玻片表面,靶基因最佳点样浓度为200 ng/μL,探针扩增标记反应体系中,Cy3-dCTP使用终浓度为2.5μmol/L,芯片杂交温度可在44℃～60℃之间任意选择。以PRRSV、CSFV、PCV1、PCV2、TGEV、HPS、PAP、E.coli和S.pp菌毒株DNA或CDNA为模板标记制备的探针均不与PRV、PPV、和JEV检测基因芯片杂交,芯片检测的灵敏度为3 pg/μL,芯片批间重复性好,同一张芯片可进行至少10次的重复杂交。该方法对8株PRV、5株PPV和JEV SA14-14-2单独或混合样品检测均为阳性,可区分伪狂犬病病毒野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品单独或混合感染的检出率分别为:单独感染PRV检出率15%(3/20),PPV 5%(1/20),JEV 0%(0/20);PRV和PPV混合感染检出率15%(3/20),PRV和JEV混合感染检出率5%(1/20),JEV和PPV混合感染检出率5%(1/20),三者混合感染的检出率5%(1/20)。与PRV、PPV和JEV多重PCR检测方法比较,芯片检测的灵敏度大大提高,同时可区分PRV野毒和基因缺失疫苗毒,对20份临床样品的检出率一致。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病 猪细小病毒病 猪流行性乙型脑炎 基因芯片 制备 检测方法
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猪乙型脑炎病毒E基因的克隆与序列分析 被引量：7
13
作者 丛晓燕 吴家强 +4 位作者 王怀忠 徐文 张秀美 王金宝 陈溥言 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第9期71-73,共3页
根据GenBank中猪乙型脑炎病毒SA14-14-2基因序列设计2对引物,从分离的猪源乙型脑炎病毒SD-001株的细胞培养物中扩增出包括E基因全长的两段基因,将扩增的目的片段进行克隆与序列分析。结果表明,所克隆的E基因编码结构域(Domain)区段与SA1... 根据GenBank中猪乙型脑炎病毒SA14-14-2基因序列设计2对引物,从分离的猪源乙型脑炎病毒SD-001株的细胞培养物中扩增出包括E基因全长的两段基因,将扩增的目的片段进行克隆与序列分析。结果表明,所克隆的E基因编码结构域(Domain)区段与SA14-14-2、P3、Beijing-1等毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别达97.2%与96.8%以上,属于Ⅲ型乙型脑炎病毒,与疫苗株SA14-14-2的Domain区相比,共有8个氨基酸位点变异。 展开更多
关键词 猪乙型脑炎病毒 E基因 序列分析
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乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因的克隆、测序与表达 被引量：4
14
作者 徐高原 陈焕春 +4 位作者 徐晓娟 李自力 孙圣福 何启盖 吴斌 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第1期22-25,共4页
目的　克隆乙型脑炎病毒E基因并在大肠杆菌中进行表达 ,为今后研制乙脑分子诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。方法　根据乙型脑炎病毒株SA14 - 14 - 2E基因的序列设计一对引物 ,采用RT -PCR技术扩增其E基因全长cD NA ,将扩增产物克隆... 目的　克隆乙型脑炎病毒E基因并在大肠杆菌中进行表达 ,为今后研制乙脑分子诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。方法　根据乙型脑炎病毒株SA14 - 14 - 2E基因的序列设计一对引物 ,采用RT -PCR技术扩增其E基因全长cD NA ,将扩增产物克隆到pBlusecriptIISK(+)载体中 ,然后亚克隆到原核表达载体PGEX -KG中 ,筛选重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)表达重组蛋白。结果与结论　获得了含全长乙型脑炎病毒E基因的重组质粒 ,经酶切和测序证实构建正确。表达的目的蛋白经SDS -PAGE和Westernblot分析证实确为乙型脑炎病毒E蛋白且有生物学活性。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 SA14—14—2株 E基因 克隆 测序 表达
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RT-PCR-RFLP方法鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒 被引量：3
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作者 张亮 田耕 +7 位作者 石双艳 袁磊 刘澣扬 黄小波 伍锐 文心田 文翼平 曹三杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1555-1560,共6页
建立一种可检测及鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的RT-PCR-RFLP方法。通过对JEV基因Ⅰ型(GⅠ)和基因Ⅲ型(GⅢ)核酸序列的比对分析,设计1对特异性引物对JEV C-PrM-E区域部分基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶SpeⅠ消... 建立一种可检测及鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的RT-PCR-RFLP方法。通过对JEV基因Ⅰ型(GⅠ)和基因Ⅲ型(GⅢ)核酸序列的比对分析,设计1对特异性引物对JEV C-PrM-E区域部分基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶SpeⅠ消化后于15g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并利用建立的RT-PCR-RFLP方法对78份临床样品进行了JEV的检测及基因型鉴定。结果显示,特异性引物可扩增出长为819bp的片段,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病毒的核酸扩增结果均为阴性。经SpeⅠ酶切,基因Ⅰ型JEV RT-PCR产物被切为568和251bp 2个条带,基因Ⅲ型JEV RT-PCR产物被切为446、251和122bp 3个条带,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV混合RT-PCR产物被切为568、446、251和122bp 4个条带,该方法最低可检出1.5pg·μL-1的JEV RNA。RT-PCR-RFLP结果显示78份临床样品中有14份为JEV阳性,其中6份为基因Ⅰ型,8份为基因Ⅲ型,与核苷酸测序分析结果一致。本研究为日本脑炎病毒的实验室诊断及基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的鉴别提供了一种快速有效的分子生物学方法。 展开更多
关键词 日本脑炎病毒 反转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 基因ⅰ型 基因Ⅲ型 鉴别
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2株乙型脑炎病毒的E基因的克隆与序列分析 被引量：2
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作者 黄小波 袁磊 +3 位作者 王伟杰 贾静 文心田 曹三杰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期338-342,共5页
目的对2009年分离自四川省崇州与内江地区的2株乙型脑炎病毒的E基因进行序列测定与分析,了解其序列特征与遗传变异情况。方法采集猪场流产死胎脑组织与蚊虫样品12份,用BHK-21细胞分离培养出2株乙型脑炎病毒,命名为JEV-CZ1株和JEV-NJ1株... 目的对2009年分离自四川省崇州与内江地区的2株乙型脑炎病毒的E基因进行序列测定与分析,了解其序列特征与遗传变异情况。方法采集猪场流产死胎脑组织与蚊虫样品12份,用BHK-21细胞分离培养出2株乙型脑炎病毒,命名为JEV-CZ1株和JEV-NJ1株。针对乙脑疫苗株SA14-14-2基因组252-2509区段设计1对引物,扩增出分离株主要抗原基因E基因并测序,与不同国家及地区的乙脑毒株进行E基因核酸序列及推导氨基酸序列的同源性比较与进化树分析。结果测序分析的E蛋白基因片段长1 500bp,编码500个氨基端残基。JEV-CZ1株与广泛使用的减毒疫苗株SA14-14-2的E基因核酸序列与推导氨基酸序列的同源性分别为87.6%和97.2%,JEV-NJ1株与SA14-14-2株的E基因核酸与氨基酸序列的同源性分别为99.5%与99.2%。JEV-CZ1株与疫苗株SA14-14-2株在E蛋白3个结构域中有15个氨基酸的差异,JEV-NJ1株有3处差异。其中JEV-CZ1株在E138位的氨基酸为Glu,符合强毒特征。通过基因遗传进化分型显示,JEV-CZ1株为基因Ⅰ型,JEV-NJ1株为基因Ⅲ型,且2株病毒与以往四川分离的毒株遗传关系较近。结论此次研究的分离株具有较强的地域性,遗传变异不大,且与疫苗株有较高的同源性。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 E基因 氨基酸序列 遗传进化分析
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流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析 被引量：6
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作者 杨耀武 齐香荣 +3 位作者 陈德胜 何孔旺 陈溥言 沈国顺 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第5期31-35,共5页
目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并... 目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并将其克隆入 pET - 32a(+)表达载体中 ,构建重组融合表达载体pET -E ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,利用IPTG诱导获得高效表达。结果　扩增的E蛋白基因片段长 1113bp ,编码 371个氨基酸残基 ,该基因片段与国内发表的减毒株SA14 - 14 - 2碱基序列同源性为 10 0 %。表达产物分子量约为 6 2kD ,经Westernblotting分析表明表达产物具有较好的抗原性。结论　通过序列分析表明 ,我国的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株未发生基因突变。表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据。 展开更多
关键词 流行性乙型脑炎病毒 SA14-14-2株 E蛋白 基因表达 原核细胞 抗原性 基因克隆
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乙型脑炎病毒寡核苷酸基因芯片研究 被引量：9
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作者 张海燕 马文丽 +4 位作者 李凌 吴清华 徐秋林 温颖 郑文岭 《实用医学杂志》 CAS 2005年第12期1244-1247,共4页
目的:制备检测乙型脑炎病毒寡核苷酸(oligo)基因芯片。方法:应用生物信息学软件设计60-meroligo探针用于制备基因芯片,乙型脑炎病毒(JEV)基因片段经限制性显示技术扩增标记,用于芯片杂交,清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果:... 目的:制备检测乙型脑炎病毒寡核苷酸(oligo)基因芯片。方法:应用生物信息学软件设计60-meroligo探针用于制备基因芯片,乙型脑炎病毒(JEV)基因片段经限制性显示技术扩增标记,用于芯片杂交,清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果:大部分oligo探针都能特异性与相应样品杂交,呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。结论:实验中建立的oligo基因芯片检测病原体方法可行,具有应用于临床诊断的前景。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 寡核苷酸基因芯片 限制性显示技术 基因芯片检测 生物信息学 软件设计 基因片段 数据分析 空白对照 阴性对照 临床诊断 光信号 特异性 病原体 制备 探针 杂交
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鸡呼肠孤病毒基因Ⅰ型变异株的分离鉴定和致病性分析
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作者 许明清 汪建华 +10 位作者 马芹 刘丹丹 张中波 赵杰 石艳红 唐代萍 王胜 郭明 胡峰 于可响 李玉峰 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第8期54-61,共8页
为探究导致山东省某肉种鸡场种鸡出现腿病的病原并进行致病性分析,本试验从该肉种鸡场收集病料,进行鸡胚分离、细胞传代、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测、序列分析、商品肉鸡的致病性试验和免疫攻毒保护试验。结果显示,分离获得1株... 为探究导致山东省某肉种鸡场种鸡出现腿病的病原并进行致病性分析,本试验从该肉种鸡场收集病料,进行鸡胚分离、细胞传代、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测、序列分析、商品肉鸡的致病性试验和免疫攻毒保护试验。结果显示,分离获得1株鸡呼肠孤病毒(ARV),命名为ARV-LL-2020,该病毒对鸡胚的致死率为100%,在鸡肝癌细胞系(LMH)上具有较强的适应性。ARV-LL-2020毒株与经典的S1133疫苗株同属基因Ⅰ型,但两者的主要抗原σC基因的核苷酸同源性为73.6%,氨基酸同源性为59.1%。ARV-LL-2020毒株回归商品肉鸡能复制出与实际生产中完全一致的发病症状。S1133株商品化弱毒活疫苗对ARV-LL-2020毒株的保护率仅有50%。结果表明,导致种鸡腿病的ARV-LL-2020毒株是1株ARV基因I型变异株,目前S1133株商品化弱毒活疫苗无法对其提供完全保护。 展开更多
关键词 鸡呼肠孤病毒 基因ⅰ型 分离鉴定 致病性
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乙型脑炎病毒靶序列浓度对LSAW基因传感器检测系统的影响 被引量：1
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作者 徐清华 陈鸣 +6 位作者 陈伟 府伟灵 王云霞 丁毅 施建峰 曹亮 汪广杰 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期765-767,共3页
目的探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)靶序列浓度值对漏声表面波(LSAW)基因传感器检测系统的影响。方法LSAW基因传感器表面固定终浓度为0.5μmol/L的JEV探针,然后用pH7.6的10mmol/L PBS缓冲液(含Na+0.3mol/L)中和终... 目的探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)靶序列浓度值对漏声表面波(LSAW)基因传感器检测系统的影响。方法LSAW基因传感器表面固定终浓度为0.5μmol/L的JEV探针,然后用pH7.6的10mmol/L PBS缓冲液(含Na+0.3mol/L)中和终浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L的JEV靶序列杂交,分别记录相位变化及反应所需时间。结果与JEV探针反应引起的相位变化是先缓慢上升后趋于缓和的趋势,以1.0μmol/L靶序列浓度为分界线;杂交平衡时间上除0.05μmol/L的时间短以外,其他的未见明显变化趋势,当靶序列浓度为1.0μmol/L,杂交反应平衡时间为33min。结论随着靶序列浓度的升高,杂交反应引起的相位变化呈典型的饱和曲线趋势;靶序列浓度为1.0μmol/L、杂交反应的平衡时间为33min,是LSAW基因传感器杂交的最适反应条件。 展开更多
关键词 漏声表面波 基因传感器 相位 乙型脑炎病毒 杂交
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