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猪非典型瘟病毒、经典猪瘟病毒、日本乙型脑炎病毒的三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用
1
作者 许浩文 陈军光 +6 位作者 马琼琼 潘杏明 郭美君 朱伟群 周莹珊 董婉玉 王晓杜 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期144-151,共8页
猪非典型瘟病毒(APPV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)均属于黄病毒科重要成员,从临床症状难以区分且三者的混合感染。为建立一种能快速鉴别检测APPV、CSFV、JEV的三重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据APPV 5'UT... 猪非典型瘟病毒(APPV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)均属于黄病毒科重要成员,从临床症状难以区分且三者的混合感染。为建立一种能快速鉴别检测APPV、CSFV、JEV的三重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据APPV 5'UTR基因、CSFV E2基因和JEV E基因分别设计引物与探针,将公司合成的重组质粒标准品pLKO.1-APPV-5'UTR、pLKO.1-CSFV-E2和pLKO.1-JEV-E按体积比1:1:1混合后均为(1×10^(8)拷贝/μL)作为模板,经反应条件优化,初步建立同时检测这3种病毒的三重q PCR方法。以本研究构建的APPV慢病毒、CSFV慢病毒、JEV慢病毒,以及猪流感病毒、猪Delta冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、诺如病毒的基因组为模板,采用建立的该方法检测,评估其特异性,结果显示,该方法仅能检测到APPV、CSFV、JEV的慢病毒,而其他病原检测结果均为阴性。选取1×10^(1)拷贝/μL~1×10^(8)拷贝/μL的混合质粒标准品和1×10^(1)TU/m L~1×10^(6)TU/m L的三种混合慢病毒液分别作为模板,采用本研究建立的方法检测,评估该方法的敏感性,结果显示,该方法对重组质粒pLKO.1-APPV-5'UTR、pLKO.1-CSFV-E2和pLKO.1-JEV-E的检测限均为1×10^(2)拷贝/μL,对3种慢病毒的检测限均为1×10^(2)TU/mL。以1×10~7拷贝/μL、1×10^(5)拷贝/μL、1×10~3拷贝/μL的质粒标准品混合物作为模板,分别进行组内和组间的重复性试验,结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数(CV)均低于4.5%。利用本研究建立的三重qPCR和已发表的3种病原的SYBR Green qPCR检测方法对111份临床样品(75份猪肛拭子样品和36份猪组织病料样品)分别检测,结果显示,该三重qPCR方法与已发表的APPV、CSFV、JEV SYBR Green qPCR方法的总符合率分别为99.10%、100%、100%。本研究首次建立的检测APPV、CSFV、JEV的三重TaqMan qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,为三者临床样品的快速鉴别检测提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪非典型瘟病毒 经典猪瘟病毒 日本乙型脑炎病毒 三重荧光定量PCR
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乙型脑炎病毒部分NS1基因假病毒的构建 被引量：3
2
作者 龙彩韵 王瑞晨 +8 位作者 姚晓慧 武婕慧 付士红 李樊 殷启凯 崔倩倩 许松涛 聂凯 王环宇 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期231-235,242,共6页
目的构建耐核酸酶的含乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)部分非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)基因的假病毒,为JEV的实验室核酸检测提供质控品,提高检测质量。方法将JEV部分NS1基因、蚊18S RNA基因和人GAPDH基... 目的构建耐核酸酶的含乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)部分非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)基因的假病毒,为JEV的实验室核酸检测提供质控品,提高检测质量。方法将JEV部分NS1基因、蚊18S RNA基因和人GAPDH基因片段次序连接克隆到该质粒上,构建重组载体pET-MS2-JEV;转化大肠杆菌后表达纯化假病毒,并对其进行耐受性和稳定性评估。结果构建了重组载体pET-MS2-JEV,表达获得的假病毒具有耐核酸酶、耐物理化学因子的特性,可在4℃和-20℃条件下稳定保存。结论本研究获得了稳定性好的含JEV部分NS1基因的假病毒,可作为JEV实验室核酸检测的质控品。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 MS2噬菌体 假病毒
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乙型脑炎病毒(JEV)ELISA检测方法的建立 被引量：8
3
作者 王吉 卫礼 +3 位作者 巩薇 高正琴 岳秉飞 贺争鸣 《中国比较医学杂志》 CAS 2010年第8期56-59,81,共5页
目的建立猪乙型脑炎病毒(JEV)抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作... 目的建立猪乙型脑炎病毒(JEV)抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 ELISA
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抗日本乙型脑炎病毒的线粒体靶向小分子化合物的筛选及鉴定
4
作者 李晓晗 陈婧 周斌 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期497-506,共10页
[目的]线粒体作为重要的能量代谢细胞器,不仅可以调控宿主先天免疫通路影响病毒复制,而且其生物学功能的改变与病毒生命周期密不可分。本文旨在确定抑制日本乙型脑炎病毒(JEV)的线粒体靶向化合物。[方法]通过体外CCK-8、间接免疫荧光、... [目的]线粒体作为重要的能量代谢细胞器,不仅可以调控宿主先天免疫通路影响病毒复制,而且其生物学功能的改变与病毒生命周期密不可分。本文旨在确定抑制日本乙型脑炎病毒(JEV)的线粒体靶向化合物。[方法]通过体外CCK-8、间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、RT-qPCR以及细胞因子检测等试验,对382种线粒体靶向化合物抗JEV的效果进行评价,筛选到的敏感药物在小鼠体内进行抗病毒效果验证。[结果]通过药物初筛,从382种药物中筛选出9种疑似抗JEV药物,进一步的体外分子试验筛选确定了其中3种药物对JEV复制有明显的抑制作用,分别为丙酮酸钠(sodium 2-oxopropanoate)、布喹那(brequinar)及松果菊苷(echinacoside)。动物试验结果表明,3种药物有效抑制了JEV在小鼠体内的增殖,给药组小鼠体重增加明显高于对照组,血液中的病毒含量更低,死亡率更低,细胞因子水平出现显著变化,其中以布喹那给药组最为明显。[结论]成功筛选出3种抗JEV的线粒体靶向化合物,为探究线粒体在病毒复制中发挥的作用提供了借鉴,也为抗JEV的临床药物研发提供了新思路。 展开更多
关键词 线粒体 日本乙型脑炎病毒 抗病毒 药物筛选 小鼠 保护率
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乙型脑炎病毒激活天然免疫应答的特点
5
作者 董昊 徐胜奎 +1 位作者 郝悦 阮文科 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第9期84-91,共8页
流行性乙型脑炎(JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)感染引起的人兽共患病,威胁人类健康和畜牧业健康发展。天然免疫作为机体防御的第一道防线,在抵抗病原感染过程中发挥重要作用。病原微生物感染机体后,宿主模式识别受体(PRRs)通过识别病原相关... 流行性乙型脑炎(JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)感染引起的人兽共患病,威胁人类健康和畜牧业健康发展。天然免疫作为机体防御的第一道防线,在抵抗病原感染过程中发挥重要作用。病原微生物感染机体后,宿主模式识别受体(PRRs)通过识别病原相关分子模式(PAMPs)诱导天然免疫发挥抗病毒功能,其中干扰素和炎性因子至关重要。为了逃逸宿主的免疫清除,JEV进化出多种策略抑制天然免疫,促进自身复制。本文通过论述JEV基因组结构和致病机理,总结机体天然免疫分子识别JEV PAMPs激活天然免疫应答的方式,并进一步阐释JEV调控天然免疫应答的策略,有利于深入理解该病毒的致病机理,为JE的防控提供思路。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒(jev) 天然免疫 免疫调控
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广西猪乙型脑炎病毒的分离及初步鉴定 被引量：4
6
作者 李茂宁 秦毅斌 +9 位作者 卢冰霞 赵武 李斌 梁家幸 肖爱欢 何颖 苏乾莲 梁保忠 刘芳 黄伟坚 《南方农业学报》 CAS CSCD 2011年第9期1151-1156,共6页
【目的】了解广西猪乙型脑炎(JE)地方流行毒株特点,为有效防控广西猪JE奠定基础。【方法】对从广西各地猪场采集疑似JE病例猪的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎、公猪精液、猪舍蚊子等靶组织样品进行猪乙型脑炎病毒(JEV)检测,并选择... 【目的】了解广西猪乙型脑炎(JE)地方流行毒株特点,为有效防控广西猪JE奠定基础。【方法】对从广西各地猪场采集疑似JE病例猪的脑组织、流产胎儿、死胎、木乃伊胎、公猪精液、猪舍蚊子等靶组织样品进行猪乙型脑炎病毒(JEV)检测,并选择部分阳性样品进行JEV分离鉴定及病毒E基因遗传进化分析。【结果】在采集的465份JE疑似病料样品中,有72份为JEV阳性;通过接种BHK-21细胞、乳鼠及SPF鸡胚,分离获得两株JEV地方分离毒株,分别命名为GP株和LC株;遗传进化分析显示,GP株和LC株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9%和99.8%;两株分离株与疫苗毒株SA14-14-2的核苷酸同源性分别为99.7%和99.9%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.6%,且均属GIII型JEV。【结论】广西受检猪群存在较严重的JEV感染,应引起重视并加强防控。 展开更多
关键词 猪 乙型脑炎病毒(jev) 分离 鉴定 E基因
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日本乙型脑炎病毒强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-NS2A诱导小鼠CD4^+T细胞应答的研究 被引量：3
7
作者 杨伟 韦冠东 +8 位作者 汤德元 曾智勇 黄涛 王彬 胡玲玲 龙冬梅 黄秋涵 廖晓糠 田红宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期1693-1700,共8页
为了解日本乙型脑炎病毒(JEV)强、弱毒株非结构蛋白的免疫效果,笔者分析了JEV强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表达的差异。通过观察JE减毒活疫苗(SA14-14-2株)和JEV贵州分离株(GZ株)分别在BHK-21细胞上出现的CPE,并收集强、... 为了解日本乙型脑炎病毒(JEV)强、弱毒株非结构蛋白的免疫效果,笔者分析了JEV强、弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A真核表达的差异。通过观察JE减毒活疫苗(SA14-14-2株)和JEV贵州分离株(GZ株)分别在BHK-21细胞上出现的CPE,并收集强、弱毒株的细胞悬液,提取总RNA,分别设计6对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A的编码基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Aq和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq,将构建成功的6种真核表达质粒免疫健康小鼠,最后采集小鼠的血液和组织分别进行JEV抗体检测和细胞免疫水平检测。研究结果显示:JEV GZ强毒株与JEV SA14-14-2弱毒株能在BHK21细胞上增殖并产生CPE现象;构建的6种真核表达质粒免疫小鼠后经血常规和T淋巴亚群检测可以极显著或显著增加CD4+和CD8+细胞的含量。表明JEV强毒株非结构蛋白所诱导的细胞免疫略优于弱毒株非结构蛋白诱导的细胞免疫,但差异不明显。本研究结果可为日本乙型脑炎病毒的病原基础研究提供参考。 展开更多
关键词 日本乙型脑炎病毒(jev) 强毒株 弱毒株 非结构蛋白 真核表达差异
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乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒的构建 被引量：12
8
作者 徐高原 王祥 +4 位作者 陈焕春 徐晓娟 李自力 何启盖 吴斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期192-197,共6页
设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中,获得重组中间转移质粒pUSK NS1。将pUSK NS1与伪狂犬病毒Ea株TK /gG /LacZ+突变株基因组共转染真核细胞IBRS 2,通过空斑纯化得到了... 设计1对引物从含有乙型脑炎病毒NS1基因的质粒pNS1上亚克隆NS1基因,将NS1基因插入到中间转移载体pUSK中,获得重组中间转移质粒pUSK NS1。将pUSK NS1与伪狂犬病毒Ea株TK /gG /LacZ+突变株基因组共转染真核细胞IBRS 2,通过空斑纯化得到了乙型脑炎病毒NS1基因重组伪狂犬病毒株TK /gG /NS1+。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒可作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗用毒株。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 NS1基因重组 伪狂犬病毒 中间转移载体
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猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量：11
9
作者 刘辉 熊金凤 +3 位作者 邹浩勇 陈杨 杨维红 何启盖 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期12-18,共7页
根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp4、30 bp和1 015 bp目的片段。以纯培养病毒抽... 根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp4、30 bp和1 015 bp目的片段。以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR。CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性。以-βactin为对照,利用本方法检测了174份临床样品(血清、肺脏和胎儿),其结果为:PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4%、4.6%和1.7%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7%。同时对临床样品中CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物进行测序分析,发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92%、90%和89%,这证实了多重PCR的阳性结果为上述3种病毒。结果证明,所建立的多重RT-PCR可用于临床检测。 展开更多
关键词 多重RT-PCR 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 乙型脑炎病毒
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猪乙型脑炎病毒SH0601株基因组序列分析及全长cDNA的构建 被引量：8
10
作者 郑浩 余丹丹 +2 位作者 孙志 高飞 袁世山 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期140-145,共6页
目的对猪源乙型脑炎病毒SH0601株进行全序列测定与分析,以了解该株病毒的遗传特征,并构建全长cDNA克隆。方法将猪源JEV SH0601株基因组RNA分5段进行RT-PCR并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO和pBluescript载体中,测定了全长cDNA序列。根据cDNA克... 目的对猪源乙型脑炎病毒SH0601株进行全序列测定与分析,以了解该株病毒的遗传特征,并构建全长cDNA克隆。方法将猪源JEV SH0601株基因组RNA分5段进行RT-PCR并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO和pBluescript载体中,测定了全长cDNA序列。根据cDNA克隆酶切图谱分析,将5个片段先后克隆入pBluescript中构建JEV全长基因组cDNA。根据E蛋白基因序列对SH0601株进行了遗传分型。结果序列分析表明:SH0601株基因组全长10977nt,与GenBank中的Beijing-1、P3、SA14和SA14-14-2株基因组全长相比,在3′NTR的10701nt处多一碱基"G",与上述4株病毒的全长核苷酸的同源率都达97.2%以上,而与国外猪源分离株KV1899和JEV/sw/Mie/41/2002全长核苷酸的同源率仅达88.7%,但SH0601株与6株病毒的全长氨基酸同源率均达97.0%以上。以E蛋白基因序列对SH0601作进化分析,该分离株属基因型Ⅲ型。结论SH0601株属于乙型脑炎病毒基因Ⅲ型。在高拷贝质粒pBluescript中可构建稳定的乙型脑炎病毒全长cDNA克隆。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 病毒基因组 全长CDNA克隆
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乙型脑炎病毒SXBJ07株的分离鉴定及序列分析 被引量：10
11
作者 王韦华 张旭 +2 位作者 张彦明 邢福珊 徐彦召 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第4期1-6,12,共7页
【目的】分离鉴定乙型脑炎病毒（JEV）,确定分离毒株的基因分型及其E区段氨基酸的序列特征。【方法】采用BHK-21细胞培养法,从猪脑组织标本中分离出1株病毒,对其进行细胞和免疫荧光试验,同时采用RT-PCR扩增并克隆该毒株的PrM、E区段核... 【目的】分离鉴定乙型脑炎病毒（JEV）,确定分离毒株的基因分型及其E区段氨基酸的序列特征。【方法】采用BHK-21细胞培养法,从猪脑组织标本中分离出1株病毒,对其进行细胞和免疫荧光试验,同时采用RT-PCR扩增并克隆该毒株的PrM、E区段核苷酸序列,利用PrM（456-695位）区核苷酸序列与36株参考序列进行基因分型分析,并对E区核苷酸序列与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的相应序列进行比对,分析分离株和疫苗株氨基酸的同源性及关键结构域的差异。【结果】分离出的病毒经细胞病变和直接免疫荧光试验证实为乙脑病毒,命名为SX-BJ07;用该病毒感染BHK-21细胞,72 h后所有细胞均发生病变（CPE）;用该病毒接种3日龄乳鼠,72 h之内即可导致乳鼠死亡;SXBJ07株PrM（456-695位）区基因分型证实,分离株属于基因Ⅰ型,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的同源性分别为87.7%和97.0%,但在E蛋白的活性关键结构域有13个氨基酸存在差异。【结论】从陕西省境内首次成功分离到1株Ⅰ型乙脑病毒,初步确定了该分离株的分子特征,对乙型脑炎的流行病学研究及其防治具有重要意义。 展开更多
关键词 猪 乙型脑炎乙脑病毒 分离鉴定 PrM基因分型 E基因
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乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究 被引量：9
12
作者 汤德元 王凤 +5 位作者 马萍 罗险峰 李春燕 曾智勇 徐健 刘建 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期1330-1336,共7页
收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计... 收集某猪场1例发病种公猪的睾丸病料,处理后采用细胞培养与乳鼠脑内接毒相结合的方法盲传并结合RT-PCR方法分离鉴定,命名为乙型脑炎病毒(JEV)贵州分离株(GZ株),然后根据GenBank登录的日本乙型脑炎病毒SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对扩增E基因的特异性引物,用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株E基因,并将E基因克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-E,经双酶切鉴定、测序及序列分析鉴定后,再将E基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建乙脑病毒E基因原核表达质粒pET-32a-E,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,得到了约59ku条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化和浓缩目的蛋白,并将其加入弗氏佐剂后免疫小鼠,免疫后采血检测抗体。结果显示:乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为乙型脑炎亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 贵州分离株 E基因 原核表达 免疫原性
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猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立 被引量：10
13
作者 车勇良 陈少莺 +4 位作者 魏宏 王隆柏 陈仕龙 周伦江 庄向生 《福建农业学报》 CAS 2006年第3期228-230,共3页
根据猪乙型脑炎病毒（JEV）基因序列，设计合成了一对引物，以JEV疫苗株为模板，建立了检测JEV的RT—PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增，获得与预期大小相符，长度为430bp的特异性目的片段；RT-PCR产物测序结果与文献报道的JE... 根据猪乙型脑炎病毒（JEV）基因序列，设计合成了一对引物，以JEV疫苗株为模板，建立了检测JEV的RT—PCR方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增，获得与预期大小相符，长度为430bp的特异性目的片段；RT-PCR产物测序结果与文献报道的JEV不同毒株的序列同源性达到98％～100％；敏感性测定该RT-PCR可扩增到10Pg的JEV—RNA。结果表明，建立的RT—PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 RT—PCR 检测
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乙型脑炎病毒的分离与鉴定 被引量：13
14
作者 汤德元 郭万柱 +3 位作者 徐志文 颜其贵 王印 王晓玉 《四川农业大学学报》 CSCD 2004年第1期70-74,共5页
通过收集母猪流产死胎和蚊子为病料 ,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离出病毒 ,进而采用血凝 (HA)实验、荧光抗体染色技术 (间接法 )、电镜实验、血清学实验及RT -PCR方法对所分离的病毒进行鉴定 ,结果表明所分离的病毒S... 通过收集母猪流产死胎和蚊子为病料 ,用乳鼠脑内接毒和细胞接毒相结合的方法盲传并分离出病毒 ,进而采用血凝 (HA)实验、荧光抗体染色技术 (间接法 )、电镜实验、血清学实验及RT -PCR方法对所分离的病毒进行鉴定 ,结果表明所分离的病毒SC株为乙脑病毒 ,其PrM/E的同源性与JEV强毒株SA14相比达 98%。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 分离 鉴定
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猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析 被引量：4
15
作者 王晓杜 赵凡凡 +4 位作者 代兵 邵东华 蒋春英 周圻 马志永 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期111-118,共8页
猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编... 猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列,插入FMDV2A和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体pAC-JEV,实时定量PCR、间接免疫荧光、Western blotting方法检测JEV自身蛋白(NS3)表达,验证复制子的自主复制能力。在pAC-JEV的结构蛋白C基因下游插入EGFP基因、猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的GP5基因构建重组复制子pAC-JEV-EGFP、pAC-JEV-HA、pAC-JEV-GP5和NS5基因缺失载体pAC-JEV-ΔNS5,该复制子载体转染BHK-21,荧光显微镜直接观察EGFP表达,Western blotting方法检测外源蛋白质(GFP、GP5、HA)表达情况。结果表明:随着转染时间延长,复制子转染细胞内NS3的表达逐渐增加,表明所构建的JEV复制子表达载体具有自主复制能力。EGFP mRNA转录水平和EGFP蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续8d以上,携带猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因的复制子载体转染BHK-21细胞后,HA和GP5能有效表达,说明复制子具有表达外源蛋白质的能力。该复制子表达载体的成功构建,为深入研究JEV各蛋白质的功能、各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 复制子 表达载体 HA GP5
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乙型脑炎病毒感染猪睾丸细胞的miRNA表达谱差异分析 被引量：5
16
作者 张元鹏 杨占娜 +8 位作者 杨利 李兰 于晓明 杜露平 陈瑾 侯立婷 乔绪稳 侯继波 郑其升 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期734-739,共6页
[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的m... [目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 猪睾丸细胞 MIRNA 高通量测序
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乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达及其初步应用 被引量：4
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作者 张雪寒 何孔旺 +2 位作者 俞正玉 郭容利 倪艳秀 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期873-877,共5页
目的克隆表达日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)的E基因,研究其抗原性,并初步作为诊断抗原建立JEV抗体检测方法。方法用RT-PCR方法扩增E基因全长,然后克隆到pFastbacTM载体中,转化宿主菌DH5a中,提取阳性克隆质粒转导到D... 目的克隆表达日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)的E基因,研究其抗原性,并初步作为诊断抗原建立JEV抗体检测方法。方法用RT-PCR方法扩增E基因全长,然后克隆到pFastbacTM载体中,转化宿主菌DH5a中,提取阳性克隆质粒转导到DH10Bac,利用通用引物鉴定阳性,提取其基因组转染昆虫细胞sf9,而后经IFA和Western blot进行鉴定。挑蚀斑纯化获得高纯度和高滴度的重组病毒,收集细胞裂解上清作为抗原建立间接ELISA方法,对不同年龄段猪血清进行检测。结果从JEV中成功克隆E基因,并在昆虫细胞中得到表达,分子量约53kD,具有良好的抗原性。建立的ELISA方法的抗原最佳包被浓度为30μg/ml,待检血清的最佳稀释度为1:40,阳性判定标准初步定为OD450≥0.3,且OD值待检血清/OD值阴性血清≥2。结论JEV的E基因经过体外昆虫细胞表达,获得抗原性良好的蛋白作为诊断抗原,用其建立的ELISA方法能很好用于猪群JEV抗体水平的检测。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 Bac-to-Bac表达 ELISA方法
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乙型脑炎病毒E蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达 被引量：5
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作者 吴玉水 任君萍 +6 位作者 黄庆生 丁天兵 张伟 宋建华 朱忠勇 张红毅 马文煜 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期130-131,135,共3页
目的 :用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒 (JEV)E蛋白。方法 :将JEVE蛋白基因亚克隆入真核表达载体 pPIC9K ,以电穿孔法转化酵母SMD116 8。用MD平板筛选重组子、G4 18筛选高拷贝转化子 ,经甲醇诱导表达后 ,SDS PAGE和免疫印迹分析... 目的 :用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒 (JEV)E蛋白。方法 :将JEVE蛋白基因亚克隆入真核表达载体 pPIC9K ,以电穿孔法转化酵母SMD116 8。用MD平板筛选重组子、G4 18筛选高拷贝转化子 ,经甲醇诱导表达后 ,SDS PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果 :由于糖基化不同 ,所表达产物的相对分子质量 (Mr)约为 1130 0 0和 780 0 0 ,表达量约为5 0mg/L。结论 :在巴斯德比赤酵母中成功地表达了JEVE蛋白 。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 E蛋白 基因克隆 蛋白表达 巴斯德毕赤酵母 电穿孔法
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乙型脑炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域抗原表位鉴定 被引量：4
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作者 闫丽萍 华荣虹 +6 位作者 亓文宝 周艳君 李国新 于海 姜一峰 田志军 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期56-60,共5页
为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGM... 为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 E蛋白 抗原表位
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猪乙型脑炎病毒囊膜E蛋白间接ELISA诊断方法的建立与初步应用 被引量：5
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作者 张宁 金洪涛 +6 位作者 丁壮 张瑞岩 刘雯 李勇 薛会亮 李丹 夏志平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第7期170-175,共6页
本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,... 本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,酶标抗体最适稀释度为1∶5000,最佳封闭条件为1%BSA,阴阳性临界值判定标准为D492 nm=0.254。该方法不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒阳性血清反应,其D492 nm<0.254,说明该方法具有良好的特异性。采用该方法对150份疑似乙型脑炎血清样品进行检测,结果显示,与某猪乙型脑炎试剂盒相比符合率为90.77%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,因此,本研究成功建立了能特异性检测抗乙型脑炎血清抗体的ELISA检测方法。 展开更多
关键词 乙型脑炎病毒 E蛋白 间接ELISA
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