hTR基因反义表达质粒构建及序列分析

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作者 安利佳 金礼吉 《大连理工大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第A01期29-33,共5页

从人的脐带血管内皮细胞中提取基因组 DNA,通过 PCR方法扩增得到了人端粒酶RNA成分 ( human telomere RNA,h TR)的基因片段 ,扩增产物经酶切克隆到逆转录病毒载体p LNCX上 ,构建了 h TR基因的反义表达质粒 .序列分析结果表明 ,PCR扩增... 从人的脐带血管内皮细胞中提取基因组 DNA,通过 PCR方法扩增得到了人端粒酶RNA成分 ( human telomere RNA,h TR)的基因片段 ,扩增产物经酶切克隆到逆转录病毒载体p LNCX上 ,构建了 h TR基因的反义表达质粒 .序列分析结果表明 ,PCR扩增得到的 h TR基因的 DNA序列与所发表的序列完全一致 .构建的反义表达载体中的目的基因正确地反向插入到逆转录病毒载体 p LNCX的克隆位点上 ,构成了 h 展开更多

关键词 脐带 端粒酶 HTR基因 pLNCX载体 反义表达质粒 序列分析 肿瘤基因治疗

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串联序列amiRNA稳定转染后对cccDNA的影响

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作者 蒲春文 王莉芬 +3 位作者 张勇 刘威 张影 丛树荣 《中国医药导报》 CAS 2011年第31期20-23,F0003,共5页

目的:观察优化设计的串联序列amiRNA(artificial microRNA)质粒表达载体长期干扰乙型肝炎病毒(HBV)后,对HBV复制源泉cccDNA的影响。方法:将前期构建的针对HBV RNA干扰效率高的单一序列及串联序列amiRNA质粒表达载体,瞬时转染入HepG2.2.1... 目的:观察优化设计的串联序列amiRNA(artificial microRNA)质粒表达载体长期干扰乙型肝炎病毒(HBV)后,对HBV复制源泉cccDNA的影响。方法:将前期构建的针对HBV RNA干扰效率高的单一序列及串联序列amiRNA质粒表达载体,瞬时转染入HepG2.2.15细胞,筛选出稳定转染细胞株,观察其对cccDNA的影响。结果:稳定转染单一序列amiRNA-HBV-4组相对于阴性对照质粒,对HBV cccDNA的抑制率为93.78%;串联序列amiRNA-HBV3-4组为99.65%,二者比较,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论:构建的针对HBV的新型amiRNA质粒表达载体可较明显地抑制HBV复制的根源cccDNA,串联序列组效果更佳,为进一步进行体内实验奠定了基础。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒(HBV) amiRNA 串联序列质粒表达载体 稳定转染 CCCDNA

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MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定 被引量：1

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作者 唐琳 陈奎生 +2 位作者 张岚 张云汉 高冬玲 《山东医药》 CAS 北大核心 2005年第16期13-14,共2页

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pc... 目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3.1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamH和Hind)鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3.1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 真核表达载体 逆转录聚合酶链反应 反义RNA表达质粒 PCDNA3.1 MMP-9基因 CDNA序列 真核表达质粒 PCR扩增 BamHⅠ 生物学功能 总RNA 胃癌组织 扩增产物 基因片段 测序分析 酶切鉴定 阳性克隆 序列设计 插入片段 基因治疗

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口蹄疫病毒VP1基因和免疫串联片段F的克隆及其在Vero细胞中的表达 被引量：1

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作者 黄桂菊 罗满林 +2 位作者 刘镇明 贺东生 耿忠海 《动物医学进展》 CSCD 2005年第5期62-66,共5页

用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem-t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)上,得到重组质粒pcDNA-VP1.根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免... 用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem-t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)上,得到重组质粒pcDNA-VP1.根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免疫串联片段F,F含有VP1基因的主要抗原位点141位～160位及200位～213位的氨基酸序列,将F片段克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)中,得到重组质粒pcDNA-F.在脂质体介导下,重组质粒pcDNA-VP1和pcDNA-F转染Vero细胞.间接免疫荧光分析表明VP1基因和F基因均在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制FMD基因疫苗奠定了基础. 展开更多

关键词 VERO细胞 VP1基因 口蹄疫病毒 片段 串联 RT-PCR方法 真核表达载体 重组质粒 间接免疫荧光 氨基酸序列 脂质体介导 easy 文献资料 设计合成 抗原位点 瞬时表达 基因疫苗 亚克隆 F基因 分析表 FMD 酶切

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人类肥胖相关新基因LYRM1真核表达载体的构建及稳定转染3T3-L1细胞系的建立

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作者 邱洁 张敏 +4 位作者 周晓玉 程锐 曹兴国 王玢 郭锡熔 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期493-497,共5页

目的:构建人LYRM1基因的真核表达载体,转染3T3-L1前体脂肪细胞,建立稳定过表达人LYRM1基因的3T3-L1前体脂肪细胞系。方法:运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His B,... 目的:构建人LYRM1基因的真核表达载体,转染3T3-L1前体脂肪细胞,建立稳定过表达人LYRM1基因的3T3-L1前体脂肪细胞系。方法:运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His B,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的3T3-L1前体脂肪细胞系,并利用Westernblot方法鉴定其表达。结果:PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确。建立了稳定转染LYRM1的3T3-L1前体脂肪细胞,成功地表达目的基因。结论:LYRM1真核表达载体的成功构建及稳定转染3T3-L1细胞系的建立为进一步研究其功能奠定了良好的实验基础。 展开更多

关键词 肥胖症/遗传学 脂细胞/细胞学 基因表达 逆转录聚合酶链反应 克隆 分子 序列分析 DNA 遗传载体 转染 质粒

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人白细胞介素16的基因克隆及其表达载体的构建

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作者 李淑玲 司传平 +3 位作者 刘玉庆 许晓群 冯进波 魏海明 《济宁医学院学报》 2005年第1期7-10,共4页

目的　通过从人外周血单个核细胞 (PBMC)中克隆编码人IL - 16的cDNA基因 ,构建人IL -16的原核高效表达系统。方法　从组胺刺激的正常人外周血单个核细胞中分离总RNA ,利用半巢式RT -PCR、T -A克隆等技术得到特异的cDNA片段 ;将含有IL - ... 目的　通过从人外周血单个核细胞 (PBMC)中克隆编码人IL - 16的cDNA基因 ,构建人IL -16的原核高效表达系统。方法　从组胺刺激的正常人外周血单个核细胞中分离总RNA ,利用半巢式RT -PCR、T -A克隆等技术得到特异的cDNA片段 ;将含有IL - 16cDNA的质粒IL - 16 -PUC18和原核表达载体PMAL -C2 经酶切、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作 ,获得重组质粒PMAL-C2 -IL - 16 ,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达工程菌 ,Westernblotting检测表达产物。结果　经序列测定证实 ,所得片段为IL - 16cDNA ;Westernblotting检测重组体中确有抗IL - 16抗体的融合蛋白表达。结论　成功克隆了中国人IL - 16cDNA ,并表达了IL - 16融合蛋白。 展开更多

关键词 白细胞介素16 基因克隆 人外周血单个核细胞 blotting IL-16 巢式RT-PCR PMAL-C2 Western CDNA基因 cDNA片段 原核表达载体 WESTEM 融合蛋白表达 T-A克隆 表达系统 总RNA 序列分析 重组质粒 DH5Α 大肠杆菌 质粒转化 诱导表达

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抗mdr1 RNA干扰真核表达载体的构建

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作者 顾玲 刘霆 +3 位作者 龚玉萍 王玉芳 杨志梅 席亚明 《四川生理科学杂志》 2005年第1期6-9,共4页

目的:构建抗mdr1RNA干扰真核表达载体。方法:根据Reynolds的设计原则,针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果:... 目的:构建抗mdr1RNA干扰真核表达载体。方法:根据Reynolds的设计原则,针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果:用PstI和SalI酶切鉴定质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3均符合设计要求,测序证实序列完全正确。结论:通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3插入位点正确,与设计序列一致,预期可用于逆转mdr1所致耐药。 展开更多

关键词 RNA干扰 mdr1 真核表达载体 编码DNA序列 RNA序列 二级结构 设计原则 人工合成 DH5Α 大肠杆菌 碱裂解法 酶切鉴定 PstⅠ 设计要求 重组质粒 靶序列 测序 Sal 致耐药 栽体

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P21-GFP融合基因表达载体的构建与在视网膜色素上皮细胞的表达定位 被引量：3

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作者 韩勇娟 曾水清 +1 位作者 胡义珍 张海江 《临床眼科杂志》 2005年第3期277-279,290,共4页

目的构建绿色荧光蛋白GFP-p21融合基因表达载体,并观察其在人视网膜色素上皮细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对视网膜色素上皮细胞细胞周期的影响提供实验基础。方法以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21cD... 目的构建绿色荧光蛋白GFP-p21融合基因表达载体,并观察其在人视网膜色素上皮细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对视网膜色素上皮细胞细胞周期的影响提供实验基础。方法以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21cDNA,应用基因重组技术与GFP基因融合,构建以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的重组表达质粒pGFP-p21。利用脂质体转染体外培养的人视网膜色素上皮细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pGFP-p21融合蛋白在细胞中的分布和定位,用WesternBlot方法分析其蛋白的表达。结果1酶切、DNA测序均证实插入片断的正确性。2荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP-C1转染组中,细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pGFP-p21转染组中,绿色荧光主要集中在细胞核内。3WesternBlot证实了pGFP-P21融合基因的表达。结论成功的构建了pGFP-p21质粒。视网膜色素上皮细胞能高效表达pGFP-p21融合基因,且主要定位于细胞核内,与p21基因的表达方式相同。 展开更多

关键词 基因表达载体 培养的人视网膜色素上皮细胞 表达定位 细胞周期蛋白激酶抑制因子 Western 绿色荧光蛋白 荧光显微镜 基因重组技术 重组表达质粒 Blot 细胞核内 融合基因 PCR扩增 脂质体转染 DNA测序 PEGFP P21基因 全长序列

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WSSV-VAP1基因克隆及在毕赤酵母中的表达 被引量：2

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作者 刘庆慧 韩文君 +1 位作者 黄倢 王清印 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期67-70,共4页

根据 WSSV-黏附蛋白(VAP1)基因序列设计了一对引物,在5'引物和3'引物中分别引入EcoRI和XbaI酶切位点.经PCR扩增,将VAP1基因克隆至穿梭载体pGAPZαA之GAP启动子下游位点,构建成含α-factor信号肽的重组表达载体,获得的重组质粒pG... 根据 WSSV-黏附蛋白(VAP1)基因序列设计了一对引物,在5'引物和3'引物中分别引入EcoRI和XbaI酶切位点.经PCR扩增,将VAP1基因克隆至穿梭载体pGAPZαA之GAP启动子下游位点,构建成含α-factor信号肽的重组表达载体,获得的重组质粒pGAPZαA-VAP1经线性化后转入毕赤氏酵母SMD1168菌株,构建成分泌型表达VAP1的酵母工程菌株.SDS-PAGE和Western-blot及结合活性检测分析表明,VAP1基因在该体系中得到成功表达,表达产物与对虾细胞膜具明显的结合活性. 展开更多

关键词 基因克隆 毕赤酵母 WESTERN-BLOT SDS-PAGE 重组表达载体 PCR扩增 毕赤氏酵母 分泌型表达 序列设计 酶切位点 穿梭载体 重组质粒 工程菌株 活性检测 P1基因 结合活性 表达产物 启动子 GAP 信号肽 线性化 分析表 细胞膜

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人肥胖基因在大肠杆菌中的表达 被引量：2

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作者 昔奋攻 李宁 吴常信 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期63-66,共4页

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能.本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5'端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,... 肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能.本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5'端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45%以上.表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性. 展开更多

关键词 大肠杆菌 肥胖基因 SDS-PAGE电泳 CDNA序列 原核表达载体 重组蛋白 PCR方法 生物学活性 脂肪含量 基因编码 扩增片段 质粒转化 温度诱导 蛋白表达 菌体蛋白 小白鼠 瘦蛋白 信号肽 CCG 密码子 CCC 分子量 表达量 纯化 造血

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鲎抗菌肽polyphemusinⅡ基因的改造、克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量：5

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作者 张钫 郑伟 韩文瑜 《新疆农业科学》 CAS CSCD 2005年第B06期31-34,共4页

中国鲎(Tachypleus trideutatus)血细胞产生的抗菌肽(Antibacterial peptide)—鲎素,具有广谱的杀菌、抑病毒和抗肿瘤细胞的作用。实验根据已报道的美洲鲎的抗菌肽polyphemusinⅡ氨基酸序列,设计了一对引物,并对原抗菌肽基因进行改造,... 中国鲎(Tachypleus trideutatus)血细胞产生的抗菌肽(Antibacterial peptide)—鲎素,具有广谱的杀菌、抑病毒和抗肿瘤细胞的作用。实验根据已报道的美洲鲎的抗菌肽polyphemusinⅡ氨基酸序列,设计了一对引物,并对原抗菌肽基因进行改造,在基因开放阅读框末端添加了Asn密码子,使抗菌肽羧基末端酰胺化,旨在提高其稳定性和抗菌活性。PCR扩增获得改造过的目的片段,连接于载体pMD18-T,测序后,与pEI-28c(+)连接,构建表达质粒pET28c-rr,测序鉴定正确后,转化大肠杆菌E.coli.BK21(DE3)。表达菌株经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导后以包涵体的形式表达,在体外表现出明显的抑菌活性。 展开更多

关键词 改造 大肠杆菌E.coli Ⅱ基因 克隆 氨基酸序列 抗菌肽基因 开放阅读框 PCR扩增 肿瘤细胞 抗菌活性 表达质粒 抑菌活性 中国鲎 血细胞 密码子 Asn 酰胺化 稳定性 包涵体 连接 测序 引物 载体

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