中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白(CP)特异性抗体的制备与应用

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作者 沈峥嵘 戴远兴 +2 位作者 郭留明 汪芷瑶 张恒木 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第9期2042-2050,共9页

中国小麦花叶病毒(CWMV)是浙江省农业科学院发现并鉴定的一种土传病毒,其RNA2编码的外壳蛋白(CP)在病毒侵染过程中发挥重要功能。为了检测该蛋白表达并分析其生物学功能,该研究采用RT-PCR方法从感染CWMV小麦病叶中扩增获得CP基因,并通过... 中国小麦花叶病毒(CWMV)是浙江省农业科学院发现并鉴定的一种土传病毒,其RNA2编码的外壳蛋白(CP)在病毒侵染过程中发挥重要功能。为了检测该蛋白表达并分析其生物学功能,该研究采用RT-PCR方法从感染CWMV小麦病叶中扩增获得CP基因,并通过In-Fusion技术构建了CWMV CP重组表达载体,将其导入BL21(DE3)菌株诱导表达;原核表达的重组CP蛋白经镍柱亲和层析纯化后注射免疫家兔,收集抗血清经亲和层析纯化获得CP多克隆抗体。Dot-ELISA、ID-ELISA、Western blot显示,该抗体不仅对CWMV具有高度的特异性,而且其效价高达1∶2.048×10^(7)、灵敏度达6.25×10^(-2)ng。应用该抗体采用Dot-ELISA、Western blot方法检测田间小麦样品显示其可用于CWMV的准确诊断,这为CWMV病毒病检测、CP定量分析及其功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 中国小麦花叶病毒 外壳蛋白 重组蛋白 多克隆抗体

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一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法 被引量：11

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作者 缪倩 季英华 +3 位作者 任春梅 魏利辉 周益军 程兆榜 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期595-599,共5页

针对小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV)在症状、传播途径、发生规律等方面高度相似、难以用常规手段鉴定的问题,根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物CWWY-R2、CW1-F2和WY1-F2,以植物总RNA为模板、CWWY-R2为引物反... 针对小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV)在症状、传播途径、发生规律等方面高度相似、难以用常规手段鉴定的问题,根据两种病毒基因序列的异同点设计了三条引物CWWY-R2、CW1-F2和WY1-F2,以植物总RNA为模板、CWWY-R2为引物反转录合成cDNA。通过优化建立了一种同步检测两种病毒的反应体系:cDNA1.6μL,引物(10μmol.L-1)各0.4μL,10×PCR Buffer(不含Mg2+)2μL,dNTPs(10mmol.L-1 each)0.4μL,Taq DNA聚合酶(5U.μL-1)0.8μL,MgCl2(25mmol.L-1)0.8μL,ddH2O 13.2μL,合计20μL;PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃50s,50℃50s,72℃90s,共30个循环,72℃延伸10min。WYMV和CWMV的PCR扩增预期目的片段分别为508和918bp。利用该方法对江苏高邮、扬州和大丰的样本进行检测,它们分别为WYMV、WYMV、CWMV单一侵染,证明该方法准确性较高,可用于两种病害同步检测。 展开更多

关键词 小麦黄花叶病毒 中国小麦花叶病毒 禾谷多粘菌 复合PCR

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中国小麦花叶病毒(CWMV)生物学特性初探 被引量：10

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作者 张巧艳 陈剑平 《浙江农业学报》 CSCD 2005年第3期155-157,共3页

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关键词 中国小麦花叶病毒 寄主范围 病毒粒子形态学

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中国小麦花叶病毒(CWMV)侵染条件下小麦内参基因的选择 被引量：4

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作者 吴讷 陈炫 +5 位作者 姜瑶瑶 张天烨 羊健 朱统泉 张恒木 陈剑平 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期1182-1187,共6页

实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择。为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异... 实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择。为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异性分析,从10个持家基因中选择8个候选基因,然后以接种CWMV的小麦样品为材料,利用qRT-PCR技术进一步检测上述8个基因在CWMV侵染条件下小麦样品中的时空表达特性。基于这些数据,通过ge Norm、Norm Finder程序分析,结果表明,2个小麦基因(即26S和CDC)在CWMV侵染前后以及不同组织中表达最为稳定,26S和CDC组合可选作CWMV与小麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因。 展开更多

关键词 内参基因 小麦 中国小麦花叶病毒 QRT-PCR

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中国小麦花叶病毒CP和CRP蛋白的原核表达、抗血清制备及RNA2侵染性克隆构建 被引量：4

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作者 孔凡惠 脱建波 +5 位作者 魏娇 唐伟 李向东 迟胜起 田延平 于金凤 《山东农业科学》 2015年第8期6-10,共5页

中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)引起的小麦土传花叶病在山东烟台、威海等地危害严重。本研究克隆了CWMV烟台分离物的衣壳蛋白(Coat protein,CP)及富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich protein,CRP)基因,并将其连接到原... 中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)引起的小麦土传花叶病在山东烟台、威海等地危害严重。本研究克隆了CWMV烟台分离物的衣壳蛋白(Coat protein,CP)及富含半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich protein,CRP)基因,并将其连接到原核表达载体p EHISTEV,转化大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,表达出分子量均为19 k D的CP和CRP。将二者从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰大耳兔4次,获得了两种蛋白的多克隆抗体。ELISA检测表明,CWMV CP和CRP抗血清的效价分别为1∶4096和1∶2048。Western blot分析证明该抗血清只与感染CWMV的小麦有特异性反应,而与健康或感染小麦黄花叶病毒的小麦无反应。利用含T3启动子的引物通过RT-PCR扩增出CWMV RNA2全长片段,经T/A克隆连接到p MD18-T,获得质粒p MD18-T-CWMV-RNA2。该质粒经XbaⅠ线性化后,利用T3 RNA聚合酶进行体外转录,转录产物摩擦接种本氏烟,15℃培养3天后,利用Western blot可从接种叶片中检测到瞬时表达的CWMV CP蛋白。 展开更多

关键词 中国小麦花叶病毒 衣壳蛋白(CP) 富含半胱氨酸蛋白(CRP) 抗血清制备 侵染性克隆

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表达中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白基因增强烟草对CWMV的抗病性 被引量：3

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作者 杨锦 靳鹏 +4 位作者 刘芃 羊健 王洋 戴良英 陈剑平 《浙江农林大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期291-295,共5页

【目的】中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起小麦黄花叶病的重要病原之一。获得表达CWMV外壳蛋白(coat protein,CP)的转基因烟草Nicotiana benthamiana(OECP)并分析其抗病性,为培育小麦抗病材料奠定工作基础。【... 【目的】中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起小麦黄花叶病的重要病原之一。获得表达CWMV外壳蛋白(coat protein,CP)的转基因烟草Nicotiana benthamiana(OECP)并分析其抗病性,为培育小麦抗病材料奠定工作基础。【方法】利用体外重组DNA技术构建含有CWMV外壳蛋白基因的表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法,获得OECP。进一步利用Western Blot和PCR检测明确CWMV的外壳蛋白在OECP中能够正常的表达。【结果】部分转基因阳性植株出现矮化表型。此外,OECP阳性植株接种CWMV后7 d的定量分析表明,OECP中CWMV运动蛋白的表达量显著受到抑制。【结论】在烟草中表达CWMV的CP蛋白基因可显著增强烟草对CWMV的抗病性。 展开更多

关键词 植物保护学 中国小麦花叶病毒(CWMV) 外壳蛋白 表达 烟草 抗病性

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中国小麦花叶病毒富含半胱氨酸蛋白多克隆抗体的制备与应用

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作者 戴远兴 郭留明 +6 位作者 何婧 沈峥嵘 耿艳飞 吕明芳 袁正杰 李静 张恒木 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期677-686,共10页

中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是小麦花叶病的重要病原体之一,长期威胁小麦的产量和品质;CWMV富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich protein,CRP)在病毒侵染过程中具有重要而复杂的功能。为了深入研究CRP的功能和CWMV... 中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是小麦花叶病的重要病原体之一,长期威胁小麦的产量和品质;CWMV富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich protein,CRP)在病毒侵染过程中具有重要而复杂的功能。为了深入研究CRP的功能和CWMV侵染机制,本研究采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)从CWMV侵染的小麦叶片中获得CRP基因编码区,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,并将重组质粒pET-CRP转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;通过镍柱亲和层析法纯化CRP重组蛋白,并用作抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。蛋白质印迹法、间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和斑点ELISA分析结果显示:纯化的CRP抗体不仅具有高度的特异性,而且效价高达1∶4096000,是未纯化抗体效价的4倍;该抗体能识别0.5 ng抗原,显示出较高的灵敏度;在1∶120000稀释条件下,该抗体能特异且灵敏地识别天然CRP。综上所述,本研究所制备的CRP抗体不但可用于田间CWMV病株样品的精准诊断,还可用于植物体内瞬时表达CRP的检测分析,为后续CRP检测、定量分析及其亚细胞定位等研究提供了依据。 展开更多

关键词 中国小麦花叶病毒 富含半胱氨酸蛋白 原核表达 蛋白质纯化 多克隆抗体

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山东省小麦土传花叶病毒病的分布与病原鉴定 被引量：5

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作者 吴斌 姜珊珊 +4 位作者 张眉 王升吉 赵玖华 徐德坤 辛相启 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期246-252,共7页

小麦土传花叶病毒病是侵染小麦的一种重要病害,该病害病原有多个病毒种类,主要为小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV),由禾谷多黏菌以持久性方式传播为害。为明确该病害在山东的最新分布状况,于2013-2016年采用田间调查,结合d... 小麦土传花叶病毒病是侵染小麦的一种重要病害,该病害病原有多个病毒种类,主要为小麦黄花叶病毒(WYMV)和中国小麦花叶病毒(CWMV),由禾谷多黏菌以持久性方式传播为害。为明确该病害在山东的最新分布状况,于2013-2016年采用田间调查,结合dot-ELISA和RT-PCR检测等方法对小麦土传花叶病毒病进行了研究。结果表明,小麦土传花叶病毒病主要分布在鲁南地区,而鲁中、鲁东、鲁北等为零星发生区。WYMV主要分布在临沂、济宁、泰安和枣庄等地;CWMV主要分布在烟台、威海、青岛、临沂和德州等地;烟台、威海、青岛、临沂为两种病毒的混发区。对CWMV主要分布区域(文登、荣成、胶州、莒南、平原、沂水、福山)的CWMV的CP基因进行系统进化聚类分析发现,CWMV的CP基因同源性为94.7%~98.3%,在进化树中聚类为两组,其中,平原、文登、福山和莒南分离物与日本分离物(登录号:AB299272.1)亲缘关系较近,沂水、荣成和胶州分离物与江苏大丰分离物(登录号:EF121374.1)亲缘关系较近。 展开更多

关键词 小麦土传花叶病毒病 小麦黄花叶病毒 中国小麦花叶病毒 痛原鉴定

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两种麦类土传花叶病毒外壳蛋白叶绿体离体跨膜运输 被引量：5

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作者 任春梅 程兆榜 +2 位作者 魏利辉 范永坚 周益军 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期163-167,共5页

根据Banerjees等(1992)的方法,建立了中国小麦花叶病毒(CWMV)和大麦黄花叶病毒(BaYMV)外壳蛋白(CP)叶绿体离体跨膜运输体系,研究了孵育时间、CP浓度对跨膜运输效率的影响。结果表明,CWMV-CP和BaYMV-CP可分别快速进入离体的小麦与大麦叶... 根据Banerjees等(1992)的方法,建立了中国小麦花叶病毒(CWMV)和大麦黄花叶病毒(BaYMV)外壳蛋白(CP)叶绿体离体跨膜运输体系,研究了孵育时间、CP浓度对跨膜运输效率的影响。结果表明,CWMV-CP和BaYMV-CP可分别快速进入离体的小麦与大麦叶绿体中,其跨膜运输所需的孵育时间均最低为5min,孵育时间超过15min后进入叶绿体中CP的量不受影响;加入跨膜体系中CP的浓度与跨膜后进入叶绿体的CP浓度呈正相关,能够实现跨膜的最低CWMV-CP和BaYMV-CP浓度分别为4.2和37.8μg.mL-1。 展开更多

关键词 中国小麦花叶病毒 大麦黄花叶病毒 外壳蛋白 跨膜运输

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3种麦类土传花叶病毒的多抗制备及检测应用 被引量：4

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作者 任春梅 程兆榜 +5 位作者 朱慧 邰丽娟 陆凤霞 鲍传华 范永坚 周益军 《江苏农业科学》 北大核心 2014年第11期143-146,共4页

采用PEG二次沉淀和蔗糖硫酸铯密度梯度离心,得到提纯的3种麦类土传花叶病毒(小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒)。透射电镜观察分别可见线状、直杆状病毒粒子,测定浓度分别达5.44、8.08、4.09 mg/m L。提纯病毒免疫新... 采用PEG二次沉淀和蔗糖硫酸铯密度梯度离心,得到提纯的3种麦类土传花叶病毒(小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒)。透射电镜观察分别可见线状、直杆状病毒粒子,测定浓度分别达5.44、8.08、4.09 mg/m L。提纯病毒免疫新西兰大白兔制备抗血清,得到的3株抗血清经酶联免疫吸附法测定效价分别达1∶12 800、1∶25 600、1∶6 400。应用样品和多抗稀释的方阵试验,建立3种多抗的双抗夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA),并对采自江苏省、安徽省、河南省、山东省的麦子病样进行检测,结果显示,阳性检出率较高,说明这3种病毒仍是我国麦子流行的主要病毒。 展开更多

关键词 小麦黄花叶病毒 大麦黄花叶病毒 中国小麦花叶病毒 抗血清制备 血清学检测

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禾谷多黏菌传小麦病毒病的分布及变化动态 被引量：29

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作者 孙炳剑 羊健 +7 位作者 孙丽英 程兆榜 谢礼 姜鸿明 郑建强 赵倩 谢联辉 陈剑平 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期969-973,共5页

为给小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)和中国小麦花叶病毒(Chinese wheatmosaic virus,CWMV)病的科学防控提供相关技术参考,于2008-2010年采用普查结合ELISA检测和电镜观察等方法,对这两种禾谷多黏菌传小麦病毒病的分布... 为给小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)和中国小麦花叶病毒(Chinese wheatmosaic virus,CWMV)病的科学防控提供相关技术参考,于2008-2010年采用普查结合ELISA检测和电镜观察等方法,对这两种禾谷多黏菌传小麦病毒病的分布进行了研究。结果表明,WYMV重病区呈现向西、向北扩展的新趋势,发现山东泰安、河南商丘、湖北丹江口、襄樊、随州等新病区,四川省仅在内江发生。江苏省两种病毒复合侵染区正在扩大,浙江病区基本消失。 展开更多

关键词 小麦 禾谷多黏菌 小麦黄花叶病毒 中国小麦花叶病毒

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小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析 被引量：1

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作者 陈炫 张天烨 +2 位作者 羊健 张恒木 陈剑平 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期98-103,共6页

真核翻译延伸因子(eukaryotic translation elongation factor,e EFs)是一种重要的多功能调控蛋白,eEF1β是eEF1的组成部分,在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用。本文通过RT-PCR扩增克隆小麦(Triticum aestivum L.)的e EF1β基因,... 真核翻译延伸因子(eukaryotic translation elongation factor,e EFs)是一种重要的多功能调控蛋白,eEF1β是eEF1的组成部分,在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用。本文通过RT-PCR扩增克隆小麦(Triticum aestivum L.)的e EF1β基因,并命名为TaeEF1β。氨基酸同源性分析发现,TaeEF1β具有高度保守性,且其保守结构域位于137～226 aa处。q RT-PCR结果表明,中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)侵染小麦植株后,可以诱导TaeEF1β基因转录水平的上调表达。另外,本文也进一步分析了TaeEF1β基因在小麦根、茎、叶的表达水平和CWMV侵染不同时间点的表达情况。 展开更多

关键词 真核翻译延伸因子 中国小麦花叶病毒 同源性分析

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