中国仓鼠卵巢细胞宿主DNA残留检测标准物质

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作者 梁文 曹梅霞 刘刚 《计量学报》 北大核心 2025年第5期754-761,共8页

为解决生物制药产品中外源性宿主细胞DNA残留检测的计量溯源难题,大批量培养中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞,研究柱层析、乙醇沉淀法、超滤法等多种提取方法,提取得到高纯度的CHO细胞基因组DNA,选择充分研究和优化的数字... 为解决生物制药产品中外源性宿主细胞DNA残留检测的计量溯源难题,大批量培养中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞,研究柱层析、乙醇沉淀法、超滤法等多种提取方法,提取得到高纯度的CHO细胞基因组DNA,选择充分研究和优化的数字PCR方法作为基因组DNA的定量方法。结果表明,相比传统的UV检测,基于数字PCR的方法能有效解决基质干扰问题,结果一致性显著提升。标准物质的均匀性和稳定性通过检验,利用10家单位的5种不同的数字PCR平台给标准物质定值,最终的拷贝数浓度定值结果为(1.06±0.12)×10^(4)copies/μL。该标准物质可促进DNA残留量检测试剂盒的开发,促进各生物制品公司DNA残留量检测结果的互认统一,实现检测结果的量值溯源。 展开更多

关键词 生物计量学 中国仓鼠卵巢细胞 宿主DNA 残留检测 数字PCR 标准物质

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转染中国仓鼠卵巢细胞人TSH受体的功能评价 被引量：1

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作者 周亚芹 张洪梅 +2 位作者 李晓永 董艳 苏青 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1224-1227,共4页

目的研究转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞人促甲状腺激素(hTSH)受体(hTSHR)的功能。方法抽提已转染hTSHR的CHO细胞基因组DNA,PCR扩增目的条带,并对产物进行序列测定。采用受体的放射配体结合分析法,以固定量125I的牛促甲状腺激素(125I-bTSH)... 目的研究转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞人促甲状腺激素(hTSH)受体(hTSHR)的功能。方法抽提已转染hTSHR的CHO细胞基因组DNA,PCR扩增目的条带,并对产物进行序列测定。采用受体的放射配体结合分析法,以固定量125I的牛促甲状腺激素(125I-bTSH)和浓度递增的未标记bTSH与hTSHR发生竞争结合反应分析受体的基本功能;通过TSH刺激试验测定细胞环磷酸腺苷(cAMP)含量,评价hTSHR的生物学活性。结果PCR扩增片段长度与预期相符,且序列完全正确。竞争结合反应表明,随着bTSH浓度的递增,125I-bTSH与hTSHR的结合量逐渐下降;TSH刺激试验显示,随着bTSH浓度的递增,细胞cAMP含量亦逐渐升高,当bTSH浓度为10 mIU/mL时,cAMP水平达到峰值。结论cDNA序列整合在CHO细胞基因组内并在细胞膜上表达的hTSHR,具有受体的基本功能特性和良好的生物学活性。该实验为自身免疫性甲状腺疾病患者血清甲状腺刺激性抗体(TSAb)和阻断性抗体(TSBAb)的检测奠定了基础。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 促甲状腺激素受体 促甲状腺激素受体抗体 环磷酸腺苷

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中国仓鼠卵巢细胞和人胚肾T细胞骨架及其迁移特性的比较

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作者 张伟 胡新德 +4 位作者 王久涛 宋玲珍 李玲玲 陈树林 赵善廷 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第8期1-7,共7页

【目的】比较中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾T(HEK293T)细胞的迁移能力,筛选适用于细胞骨架形态和外源基因对细胞迁移影响研究的细胞系。【方法】通过免疫荧光组织化学比较CHO和HEK293T细胞骨架的形态差异,通过延时成像和划痕试验比较... 【目的】比较中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人胚肾T(HEK293T)细胞的迁移能力,筛选适用于细胞骨架形态和外源基因对细胞迁移影响研究的细胞系。【方法】通过免疫荧光组织化学比较CHO和HEK293T细胞骨架的形态差异,通过延时成像和划痕试验比较细胞迁移能力,通过免疫印迹比较2株细胞系细胞骨架基因的相对表达,并从细胞骨架差异和结构基因的选择性表达方面解释细胞迁移能力的差异。【结果】CHO和HEK293T细胞系的细胞骨架在形态上存在较大差异,HEK293T细胞系的核质比是CHO细胞的2.25倍;CHO细胞比HEK293T细胞的迁移能力强,是HEK293T细胞的2.9倍;2种细胞内α-Tubulin/β-Actin的比率存在较大差异,CHO是HEK293T的1.2倍。【结论】细胞中微管微丝的差异性分布及结构基因Tubulin和Actin的选择性表达是细胞迁移特性不同的关键因素。CHO细胞适用于涉及细胞骨架形态和外源基因对细胞迁移影响的研究,HEK293T细胞不适用于此类研究。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 人胚肾T细胞 细胞骨架 迁移

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人源靶向补体抑制物CR2-CD59在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

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作者 郭彦 寇志华 +7 位作者 孙世惠 张传福 赵光宇 于虹 宋宏彬 乔飞 陈万荣 周育森 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期887-890,共4页

目的构建人源靶向补体抑制物CR2-CD59,并筛选中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)高效表达细胞株。方法运用FuGENE6转染试剂,将含有人CR2-CD59的重组PEE14.1质粒转入CHO细胞,蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)筛选出阳性克隆,并利用... 目的构建人源靶向补体抑制物CR2-CD59,并筛选中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)高效表达细胞株。方法运用FuGENE6转染试剂,将含有人CR2-CD59的重组PEE14.1质粒转入CHO细胞,蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)筛选出阳性克隆,并利用无血清培养基对CHO细胞表达株进行培养获得重组蛋白,以ELISA、SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定。结果成功构建PEE14.1-CR2-CD59重组质粒,获得CHO细胞稳定表达株。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白CR2-CD59的相对分子质量同预期结果一致。ELISA和Western blot鉴定重组蛋白CR2-CD59可与CR2、CD59多克隆抗体特异性结合。且与含血清培养基相比,无血清培养基能明显提高CHO细胞的蛋白表达量(P<0.05)。结论在CHO细胞中成功表达人源靶向补体抑制物CR2-CD59。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 CR2-CD59 补体

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野生型人DNA polβ高表达中国仓鼠卵巢细胞系的建立及其生物学特征

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作者 李敏 贺颖 +1 位作者 赵国强 董子明 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期121-124,共4页

脂质体转染法将野生型人DNA聚合酶beta(polβ)重组绿色荧光蛋白表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞系(CHO),经G418筛选得到稳定高表达人野生型polβ的CHO细胞.通过RT-PCR方法检测转染细胞polβmRNA的表达水平,流式细胞仪测细胞周期,软琼脂... 脂质体转染法将野生型人DNA聚合酶beta(polβ)重组绿色荧光蛋白表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞系(CHO),经G418筛选得到稳定高表达人野生型polβ的CHO细胞.通过RT-PCR方法检测转染细胞polβmRNA的表达水平,流式细胞仪测细胞周期,软琼脂实验测细胞恶性增殖能力,6-TG实验测细胞自发突变率,以探讨转染细胞的生物学特性.结果显示,转染细胞polβ的mRNA的表达较空载体转染细胞、对照细胞增加,细胞周期多被阻滞在S期,细胞软琼脂集落形成率增高,自发突变率增加,表明polβ的过表达与细胞周期的分布、细胞恶性增殖程度、遗传稳定性相关. 展开更多

关键词 DNA聚合酶beta 转染 细胞周期 自发突变率 中国仓鼠卵巢细胞

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基因工程改造与中国仓鼠卵巢细胞凋亡 被引量：1

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作者 张存超 寇庚 王皓 《化学与生物工程》 CAS 2014年第12期1-3,8,共4页

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是表达重组单克隆抗体常用的工程细胞。在细胞培养过程中,凋亡是限制重组蛋白产量提高的重要因素之一。对CHO细胞进行基因工程改造是抑制细胞凋亡的重要途径。主要从细胞凋亡信号途径、细胞信号通路以及microRNA... 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是表达重组单克隆抗体常用的工程细胞。在细胞培养过程中,凋亡是限制重组蛋白产量提高的重要因素之一。对CHO细胞进行基因工程改造是抑制细胞凋亡的重要途径。主要从细胞凋亡信号途径、细胞信号通路以及microRNA等方面综述了运用基因工程手段对CHO细胞凋亡改造的进展,并探讨了潜在的基因工程靶点。 展开更多

关键词 凋亡 基因工程 MICRORNA 中国仓鼠卵巢细胞

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王浆主蛋白作为胎牛血清替代物培养中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1的效果及作用机制 被引量：1

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作者 钱浩诚 蒋晨旻 +1 位作者 陈华才 沈立荣 《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期1-9,共9页

用王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)部分代替胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO-K1),比较添加不同MRJPs/FBS(M/F)比例的培养基对细胞相对增殖率的影响。四唑盐比色法(... 用王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)部分代替胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO-K1),比较添加不同MRJPs/FBS(M/F)比例的培养基对细胞相对增殖率的影响。四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)结果显示:当M/F比例为50/50时对细胞的促增殖作用最显著;与完全培养基对照组(M/F 0/100)相比,培养48与72 h时的相对活细胞数分别上升了25.1%和13.6%。细胞成像仪分析表明,M/F 50/50培养基的细胞密度最高,其细胞直径显著大于完全培养基对照组。流式细胞仪结果显示,与完全培养基对照组相比,M/F 50/50培养基中的细胞增殖指数(proliferation index,PI)提高了19.4%,推测MRJPs的促细胞增殖作用可能与DNA、蛋白质及酶的合成有关。拉曼光谱检测结果显示,各处理组培养基的细胞光谱图之间没有显著差异,说明MRJPs在促进细胞增殖的同时维持了细胞的稳定性。以上结果证明,MRJPs可以部分替代FBS培养生物医药产业中应用广泛的CHO-K1细胞,降低细胞培养成本,具有产业化前景,并为蜂王浆深加工提供新的用途。 展开更多

关键词 王浆主蛋白 中国仓鼠卵巢细胞 胎牛血清 促增殖 细胞周期 拉曼光谱

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抗体高产中国仓鼠卵巢细胞细胞株生理生化特征、糖代谢及单克隆抗体基因表达量的分析

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作者 张存超 赵亮 +3 位作者 陈飞 范里 王泽宋 谭文松 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第6期1032-1038,共7页

产物比生成速率是衡量细胞株表现的重要指标,研究产物比生成速率有差异的细胞株有助于深入理解此参数,进而为获得具有高产物比生成速率的细胞株提供借鉴。以表达单克隆抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为研究对象,通过有限稀释法筛选获得了... 产物比生成速率是衡量细胞株表现的重要指标,研究产物比生成速率有差异的细胞株有助于深入理解此参数,进而为获得具有高产物比生成速率的细胞株提供借鉴。以表达单克隆抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为研究对象,通过有限稀释法筛选获得了抗体比生产速率比对照提高57.8%的亚克隆。以此为基础,对其生理生化特征、葡萄糖代谢以及抗体轻重链基因表达量进行了详细的分析。此亚克隆在Hyclone SFM4CHO培养基批次培养中,最高活细胞密度比对照降低了68.6%,其在指数生长期细胞干重、细胞直径、胞内总蛋白含量及胞内总蛋白和细胞直径比与对照相比均有不同程度的增加,且其表达产物的轻重链基因和信使RNA相对含量均有所提高。代谢方面,此亚克隆的葡萄糖比消耗速率比对照增加了77.9%,指数生长期线粒体相对合成活性比对照增加了172.5%,有助于增加产物的翻译速率。通过研究对表达单克隆抗体的高产亚克隆生理生化特征、葡萄糖代谢以及抗体轻重链基因表达量的分析,可为深入理解细胞培养过程中产物比生成速率的提高提供借鉴,同时为高产细胞株的构建和筛选提供指导。 展开更多

关键词 有限稀释法 中国仓鼠卵巢细胞 抗体比生产速率 葡萄糖代谢

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甲基叔丁基醚对斑马鱼及中国仓鼠卵巢细胞的毒性效应 被引量：2

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作者 洪文旭 熊法德 曾序春 《安徽农业科学》 CAS 2017年第2期4-6,99,共4页

[目的]研究甲基叔丁基醚(MTBE)对斑马鱼和中国仓鼠卵巢细胞的毒性作用及氧化应激效应,为其科学、合理应用提供依据。[方法]应用半静态试验法研究不同浓度MTBE对斑马鱼的急性毒性效应,以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为模型,分析不同浓度MTBE对... [目的]研究甲基叔丁基醚(MTBE)对斑马鱼和中国仓鼠卵巢细胞的毒性作用及氧化应激效应,为其科学、合理应用提供依据。[方法]应用半静态试验法研究不同浓度MTBE对斑马鱼的急性毒性效应,以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为模型,分析不同浓度MTBE对CHO细胞增殖水平和氧化应激相关酶活力水平的影响。[结果]MTBE对斑马鱼的48 h LC50值为71.5 mg/L;在细胞试验中,当MTBE暴露浓度高于5.0 mmol/L时,CHO细胞增殖水平受到明显抑制(P<0.05);当MTBE暴露浓度达到50.0 mmol/L时,SOD活力明显上升(P<0.05)。当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时,CAT活力达到最大值且与对照组差异显著(P<0.05);当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时,CHO处理组GSH-Px活力明显上升(P<0.05)。[结论]MTBE暴露可以诱导斑马鱼和CHO细胞的毒性作用,而氧化应激酶活力水平的改变可能是MTBE毒性作用之一。 展开更多

关键词 甲基叔丁基醚 斑马鱼 中国仓鼠卵巢细胞 毒性作用 氧化应激

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定点整合β1,4半乳糖基转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶1和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ的CHO工程细胞株构建

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作者 李仙红 贾润清 +4 位作者 王友亮 漫未玲 朱天昊 阎新龙 林艳丽 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第4期576-585,共10页

对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建... 对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建3个糖基转移酶共同表达的打靶载体,分别是β1,4半乳糖基转移酶(B4GALT1)、α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ(GnTⅢ),并利用重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)将3个糖基转基因酶基因定点整合到CHO Rosa26位点中。PCR证实了3个糖基转移酶成功定点整合Rosa26位点,qRT-PCR证实3个糖基转移酶的mRNA表达水平均在50000倍以上,蛋白质免疫印迹法证实3个糖基转移酶的蛋白质表达水平均在4倍以上(P<0.001)。成功构建了Rosa26位点定点整合3个糖基转移酶的CHO工程细胞株。 展开更多

关键词 β-1 4半乳糖基转移酶 α-2 6-唾液酸转移酶1 N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ 规律成簇的间隔短回文重复技术 重组酶介导的盒式交换技术 中国仓鼠卵巢细胞

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基于位点特异性整合评价CHO细胞表达系统启动子活性的研究

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作者 鲁晨 王子玉 +4 位作者 蔡燕飞 邓勇强 金坚 丁学峰 陈蕴 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1400-1408,共9页

工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等。转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的... 工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等。转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的作用。启动子筛选大部分通过瞬时转染或随机整合,但存在拷贝数不明确或整合位点随机等而无法准确评价启动子活性。位点特异性整合在一定程度上降低位置效应对外源基因造成的影响,并有可能提高外源基因的表达水平。本课题组前期在CHO细胞基因组中发现并验证了多个可稳定表达外源蛋白质的位点,本研究选择其中1个位点(2c6)用于启动子活性的评价。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将猿猴病毒早期启动子(SV40)、小鼠延伸因子-1α(mEF-1α)、鸡β-肌动蛋白(cACTB)启动子和人磷酸甘油酸激酶启动子(hPGK)调控的报告基因(EGFP)表达盒定点整合至2c6位点上。通过流式分选仪分析细胞平均荧光强度,qPCR检测EGFP的mRNA水平,综合评价启动子的活性。结果表明,mEF-1α和cACTB启动子的活性优于SV40和hPGK。2次流式分选结果表明,位点特异性整合可以更为精确评价CHO细胞表达系统启动子活性。 展开更多

关键词 启动子评价 定点整合 中国仓鼠卵巢细胞 CRISPR/Cas9

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重组人IL-12在CHO细胞中高效表达克隆的筛选及产物的生物学活性分析 被引量：5

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作者 吕锐 张文卿 +1 位作者 于红 李丹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期564-566,共3页

目的:重组人白细胞介素-12(rhIL-12)真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-p70)转染CHO细胞,筛选高效稳定表达克隆;并对表达产物进行生物学活性分析。方法:采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5-his-p70转入CHO细胞;用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳... 目的:重组人白细胞介素-12(rhIL-12)真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-p70)转染CHO细胞,筛选高效稳定表达克隆;并对表达产物进行生物学活性分析。方法:采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5-his-p70转入CHO细胞;用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳性表达克隆,并进行单克隆扩增;RT-PCR进行表达鉴定;ELISA检测各克隆rhIL-12的表达量;应用淋巴细胞增生实验及细胞内细胞因子染色方法分析rhIL-12的生物学活性。同时,对筛选出的阳性克隆进行表达稳定性观察。结果:RT-PCR结果显示,选取的20个阳性克隆均可扩增出1800bp的特异性片段;ELISA表明,其中6个克隆rhIL-12表达水平较高(312.69～719.10ng/L),最高表达量达到719ng/L(5×104个细胞,48h);生物学活性分析表明,表达的rhIL-12可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV反应的CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞克隆的频数;并且,可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV刺激的增生反应效能。阳性克隆在维持量的筛选药物(2ng/LBlasticidin)压力下传代6个月,其表达水平无明显变化。结论:rhIL-12真核表达载体(pcDNA6/v5-his-p70)能在CHO细胞中高效稳定表达;其表达产物具有良好的生物学活性。 展开更多

关键词 白细胞介素-12 中国仓鼠卵巢细胞 基因表达

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北京早园竹叶不同提取组分对CHO细胞Akt信号通路的影响 被引量：3

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作者 梅晶 祖桂芳 +2 位作者 赵晓红 何颖 孙健 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第3期248-251,共4页

通过比较北京早园竹叶提取物中的主要活性组分黄酮苷类、酚酸类及总提取物3个组分对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的增殖、凋亡及Akt信号通路作用差别,考察竹叶提取物对正常细胞可能产生有害作用的活性组分。采用MTT法检测细胞增殖作用、Annexi... 通过比较北京早园竹叶提取物中的主要活性组分黄酮苷类、酚酸类及总提取物3个组分对中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的增殖、凋亡及Akt信号通路作用差别,考察竹叶提取物对正常细胞可能产生有害作用的活性组分。采用MTT法检测细胞增殖作用、Annexin V-FITC/PI双染流式法测细胞凋亡、In Cell Analyzer 1000活细胞图像分析系统测定Akt信号通路的活化。结果显示:1)50～400μg/mL范围内3种组分对细胞存活率的影响无明显变化,当质量浓度≥800μg/mL时细胞增殖率明显下降(P<0.05),细胞毒性作用明显,且以酚酸类组分作用最强;2)不同组分的竹叶提取物在200～800μg/mL范围内与空白组比较均可降低细胞凋亡率(P<0.05),但总提取物和黄酮苷类在质量浓度为1600μg/mL时本身可诱导CHO细胞的凋亡增加,差异显著(P<0.05),且以黄酮苷类诱导的细胞凋亡率最高,达14.21%;3)与对照组比较,黄酮苷类在100～800μg/mL剂量条件下,对Akt的活性无明显影响,总提取物在400、800μg/mL时Akt的激活率明显增加(P<0.01),而酚酸类在100～800μg/mL范围内,随剂量增加,激活率增高,呈明显的剂量-反应关系(r=0.996,P<0.01)。由此可见3种不同提取物组分对CHO细胞的作用是有差别的,其中酚酸类可能是产生有害作用的主要组分。 展开更多

关键词 竹叶提取物 黄酮苷类 酚酸类 细胞增殖 细胞凋亡 AKT通路 中国仓鼠卵巢细胞

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凝血因子Ⅶ高表达细胞的高通量筛选方法 被引量：1

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作者 彭林 李成媛 +3 位作者 熊文典 蔡燕飞 金坚 李华钟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期722-726,共5页

针对哺乳动物细胞表达克隆的耗时较长的筛选过程,作者通过流式细胞仪对细胞进行快速筛选和纯度检测。利用流式细胞仪对电转细胞进行分选,利用点杂交和western blot方法筛选高表达克隆。流式细胞仪分选后的细胞,经点杂交和WB检测后获得的... 针对哺乳动物细胞表达克隆的耗时较长的筛选过程,作者通过流式细胞仪对细胞进行快速筛选和纯度检测。利用流式细胞仪对电转细胞进行分选,利用点杂交和western blot方法筛选高表达克隆。流式细胞仪分选后的细胞,经点杂交和WB检测后获得的CHO-r FVII-1细胞,表达r FVII细胞的比例为99.9%,同时与传统筛选方法获得的CHO-r FVII克隆比较后发现,两株细胞具有相同的r FVII产量。作者基于流式细胞仪建立了快速筛选高表达重组药物蛋白克隆的筛选的高通量方法和纯度检测的方法,为其他在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的筛选提供参考。 展开更多

关键词 高通量 中国仓鼠卵巢细胞 流式细胞仪 重组蛋白

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CHO-K1细胞株的建立及其在药物安全性筛选方面的应用

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作者 张之东 陈慧 +2 位作者 郝六平 魏转 李丽娟 《河北科技大学学报》 CAS 北大核心 2010年第2期137-141,共5页

研究了稳定表达hERG基因的CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株及其在药物研发安全性筛选方面的应用。使用Lipofectamine 2000系统将hERG基因转染入CHO-K1细胞,用Western Blot检测其表达,并进一步通过FluxORTM Thallium Assay Kits验证;同... 研究了稳定表达hERG基因的CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株及其在药物研发安全性筛选方面的应用。使用Lipofectamine 2000系统将hERG基因转染入CHO-K1细胞,用Western Blot检测其表达,并进一步通过FluxORTM Thallium Assay Kits验证;同时使用FluxORTM Thallium Assay Kits检测Cisapride和Dofetilide对hERG通道的抑制性。建立了4株稳定表达hERG基因的CHO-K1细胞株,Cisapride和Dofetilide对hERG通道的IC50分别为86.7 nmol.L-1和28.1 nmol.L-1。hERG基因成功地在CHO-K1细胞株实现了稳定表达,此细胞株可用于FluxORTM Thallium Assay Kits系统,用于药物研发安全性筛选,以评估化合物潜在的心脏毒性。 展开更多

关键词 HERG 中国仓鼠卵巢细胞 FluxORTM

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CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

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作者 何伟 邹萍 张敏 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期1182-1186,共5页

目的:构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中呈分泌型表达,为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。方法:采用多聚酶链反应(PCR)技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA(cDNA)的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白I... 目的:构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中呈分泌型表达,为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。方法:采用多聚酶链反应(PCR)技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA(cDNA)的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中,获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG;采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株;免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。结果:DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点,CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达,其分子量大小和预期的基本一致,该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。结论:成功构建pcDNA/CD80-IgG真核表达载体,并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。 展开更多

关键词 融合基因蛋白质类 CD80/IgG 免疫逃逸 免疫疗法 中国仓鼠卵巢细胞

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人骨保护素在CHO细胞内初步稳定表达

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作者 孟凡星 李瑞香 臧晓怡 《中国骨质疏松杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期611-613,665,共4页

目的构建人OPG的稳定表达载体,并在DHFR-型CHO细胞内稳定表达。方法用RT-PCR的方法获得人全长OPG的编码基因,并将其克隆入载体pcDNA3.1-DHFR/CT-GFP,鉴定无误后,转染DHFR-型CHO细胞,经MTX筛选获得阳性表达OPG的细胞株。结果成功构建人OP... 目的构建人OPG的稳定表达载体,并在DHFR-型CHO细胞内稳定表达。方法用RT-PCR的方法获得人全长OPG的编码基因,并将其克隆入载体pcDNA3.1-DHFR/CT-GFP,鉴定无误后,转染DHFR-型CHO细胞,经MTX筛选获得阳性表达OPG的细胞株。结果成功构建人OPG的稳定表达载体,并获得阳性表达OPG的细胞株。结论全长人OPG基因可以在CHO细胞内成功稳定表达,这为OPG的功能研究及临床应用奠定物质基础。 展开更多

关键词 骨保护素 二氢叶酸还原酶 中国仓鼠卵巢细胞

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稳定表达人源α2A-肾上腺素受体细胞系的建立 被引量：3

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作者 杨怿 李玉蕾 +3 位作者 刘梦 周培岚 苏瑞斌 宫泽辉 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期576-581,共6页

目的建立稳定表达人源α2A-肾上腺素能受体(α2A-AR)的细胞系。方法将带有潮霉素B(Hygro)抗性的α2A-AR(pc DNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR)重组质粒通过脂质体介导转染至已表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的蛋白激酶A催化亚基(PKAcat)的中... 目的建立稳定表达人源α2A-肾上腺素能受体(α2A-AR)的细胞系。方法将带有潮霉素B(Hygro)抗性的α2A-AR(pc DNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR)重组质粒通过脂质体介导转染至已表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的蛋白激酶A催化亚基(PKAcat)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(以Hygro 200 mg·L-1进行压力筛选后,采用PKA重分布实验筛选阳性克隆),然后使用实时定量PCR验证α2A-AR受体在转录水平的表达,最后以时间分辨荧光共振能量转移免疫实验检测c AMP含量以鉴定受体功能。结果 PKA重分布实验结果表明,CHO-PKAcat-α2A-AR 7号克隆反应性良好;与CHO-PKAcat-EGFP细胞相比,该细胞系α2A-AR m RNA表达水平较高(P<0.01),且多次传代能保持稳定;在α2A-AR激动剂作用后,能显著抑制forskolin引起的c AMP水平升高(P<0.01)。结论成功构建稳定表达α2A-AR的CHO-PKAcat-α2A-AR细胞系,可用于药物筛选及机制研究。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 受体 肾上腺素α2A 蛋白激酶A c AMP

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弱化抗性标记筛选高表达CHO细胞株的方法建立 被引量：3

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作者 刘苏 田浤 +1 位作者 王驰 姚文兵 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期617-622,共6页

为了优化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法,将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸。经G418筛选,转染含突变型NPT表达载体的细胞存活率显著低于转... 为了优化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法,将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸。经G418筛选,转染含突变型NPT表达载体的细胞存活率显著低于转染含野生型NPT表达载体的细胞存活率。以绿色荧光蛋白-抗体Ig G1 Fc结构域融合蛋白为报告基因,验证了突变后新霉素磷酸转移酶对抗生素G418抗性减弱。经G418持续加压培养3周后,转染含突变型NPT表达载体的细胞中EGFP的表达量显著高于转染含野生型NPT表达载体的细胞,表明其具有筛选出高表达单克隆细胞株的潜力。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 新霉素磷酸转移酶 增强型绿色荧光蛋白 高表达系统

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外源蛋白在CHO细胞染色体上一个新位点的定点整合和稳定表达 被引量：2

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作者 胡湾湾 丁学峰 +4 位作者 蔡燕飞 陈蕴 段作营 金坚 李华钟 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期487-495,共9页

寻找中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体上稳定表达位点是解决CHO细胞长期培养表达不稳定问题的有效手段。本课题组前期利用慢病毒转染将示踪基因(Zsgreen1)整合CHO细胞染色体上并发现多个潜在稳定表达位点。本研究验证了其中一个位点稳定表... 寻找中国仓鼠卵巢(CHO)细胞染色体上稳定表达位点是解决CHO细胞长期培养表达不稳定问题的有效手段。本课题组前期利用慢病毒转染将示踪基因(Zsgreen1)整合CHO细胞染色体上并发现多个潜在稳定表达位点。本研究验证了其中一个位点稳定表达外源蛋白的能力,该位点位于染色体NW_003614241.1上148052~148157 bp区域。首先观察Zsgreen1基因的表达情况,随后采用CRISPR/Cas9技术将增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点整合至该位点,获得3株EGFP基因定点整合的细胞,经60代悬浮培养,细胞荧光强度无明显变化,证明此位点可稳定表达EGFP基因。采用同样方法构建了表达人血清白蛋白(HSA)基因的重组CHO细胞株,经Western blot验证,此位点可分泌表达HSA,表明上述位点可定点整合和稳定表达外源蛋白。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 定点整合 稳定表达 新位点 中国仓鼠卵巢细胞

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