丝裂原活化蛋白激酶15(mitogen-activated protein kinase 15,MAPK15),又称ERK7或ERK8,是MAPK家族的非典型新成员。MAPK15不同程度地促进不同肿瘤细胞的增殖、迁移、自噬等细胞活动。本研究以MAPK15为靶点,筛选特异性的MAPK15纳米抗体,...丝裂原活化蛋白激酶15(mitogen-activated protein kinase 15,MAPK15),又称ERK7或ERK8,是MAPK家族的非典型新成员。MAPK15不同程度地促进不同肿瘤细胞的增殖、迁移、自噬等细胞活动。本研究以MAPK15为靶点,筛选特异性的MAPK15纳米抗体,评估其是否能够作为免疫组织化学和Western印迹中的一抗用于其抗原表达的检测,并探究该纳米抗体在B16-F10黑色素瘤细胞中的作用。通过噬菌体展示技术从B16-F10黑色素瘤细胞纳米抗体文库中进行筛选,得到1株MAPK15特异性纳米抗体,命名为MAPK15-VHH;将该菌株构建原核表达载体,进行优化诱导表达条件时发现,0.6 nmol/L IPTG,15℃,100 r/min条件下该纳米抗体的上清表达量最高。通过竞争ELISA法检测MAPK15-VHH的亲和力,结果显示,该抗体KD值为0.9829。通过Western印迹和免疫组织化学检测脑组织中MAPK15在蛋白质水平的表达量及分布情况,结果表明,MAPK15-VHH可与组织中的MAPK15结合,用于检测MAPK15蛋白的表达情况。在B16-F10黑色素瘤细胞中过表达MAPK15后向其中添加MAPK15-VHH,通过CCK8、Western印迹以及实时荧光定量PCR检测其对该细胞增殖和自噬的影响,结果显示,该MAPK15-VHH能作为MAPK15的拮抗剂,抑制B16-F10细胞的增殖和自噬,从而抑制黑素瘤细胞的生长。综上所述,本研究成功得到一株亲和力较强的MAPK15纳米抗体,可用于Western印迹及免疫组织化学以检测MAPK15在蛋白质水平的表达及分布;此外,该MAPK15纳米抗体可以作为MAPK15拮抗剂,有效地抑制B16-F10细胞的增殖和自噬进程,为临床检测试剂和治疗药物的开发提供理论基础。展开更多
p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径是成肌细胞分化过程中重要的调节途径。p38 M APK蛋白在成肌细胞分化过程中受上游丝裂原活化蛋白激酶激酶3(M KK3)、丝裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)的激活而活化其下游成肌分化蛋白(MyoD)、肌生成素...p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径是成肌细胞分化过程中重要的调节途径。p38 M APK蛋白在成肌细胞分化过程中受上游丝裂原活化蛋白激酶激酶3(M KK3)、丝裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)的激活而活化其下游成肌分化蛋白(MyoD)、肌生成素5(Myf5)、肌形成蛋白(myogenin)、肌肉调节因子4(MRF4)等肌肉调节因子。p38 MAPK信号途径的活化可以进一步增加骨骼肌纤维细胞蛋白含量,增加肌纤维长度和横截面直径,使骨骼肌纤维在数量不变的前提下质量大幅度提高,本文就p38 MAPK信号途径调节骨骼肌生长发育的机理进行综述。展开更多
目的观察骨关节炎家兔关节软骨组织中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路蛋白表达以及活化的时相变化,明确上述蛋白在骨关节炎(osteoarthritis,OA)发展中的作用。方法用30只家兔制作OA模型,分别于术...目的观察骨关节炎家兔关节软骨组织中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路蛋白表达以及活化的时相变化,明确上述蛋白在骨关节炎(osteoarthritis,OA)发展中的作用。方法用30只家兔制作OA模型,分别于术后4、8、12周各处死10只,另选10只行假手术作为对照组。取关节软骨,实时定量RT-PCR测定MAPKs mRNA表达;Western blot法测定MAPKs总蛋白以及磷酸化状态蛋白的表达。结果造模术后几个时间点MAPKs(包括ERK1/2、P38 MAPK、JNK)的基因表达与蛋白表达均无明显变化;与正常对照相比,磷酸化ERK1/2在术后4、8、12周均有高水平表达,磷酸化P38 MAPK术后4周高水平表达,磷酸化JNK术后4、8周高水平表达,其他时间点差异无统计学意义。结论关节炎软骨组织中MAPKs信号通路的活化主要依赖于信号通路蛋白的磷酸化,而非总蛋白表达的上调;信号通路蛋白的活化存在时相差异。展开更多
目的:观察P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)抑制剂SB203580对TNF-α诱导的原代培养大鼠小胶质细胞高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)表达的影响。方法:采用原代培养大鼠小...目的:观察P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)抑制剂SB203580对TNF-α诱导的原代培养大鼠小胶质细胞高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)表达的影响。方法:采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立对照组、TNF-α组(25 ng/m L)、TNF-α(25 ng/m L)+SB 203580组(10μmol/L)、SB203580组(10μmol/L),各组细胞经药物处理16 h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1的表达情况,Western印迹检测细胞HMGB1和磷酸化p38MAPK表达情况,用反转录PCR检测HMGB1 m RNA表达。结果:经TNF-α刺激后,大鼠小胶质细胞及其培养上清液中HMGB1蛋白表达增高;SB 203580可抑制TNF-α诱导的磷酸化p38 MAPK表达(P<0.01),同时下调HMGB1m RNA和HMGB1蛋白的表达。结论:TNF-α可诱导小胶质细胞晚期炎症因子HMGB1的表达,并且其诱导机制与p38 MAPK被快速激活相关。展开更多
