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丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用
被引量：
4
1
作者
李健蕊
武燕彬
+3 位作者
司书毅
陈鸿珊
蒋建东
彭宗根
《中国医学科学院学报》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第1期98-101,共4页
目的应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3-4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型。方法将质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得...
目的应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3-4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型。方法将质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3-4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性。结果建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量。在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%。蛋白酶的Km值为4.74μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L。结论建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选。
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关键词
丙型肝炎病毒
丝氨酸蛋白水解酶
高通量筛选模型
荧光共振能量转移
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职称材料
牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定
被引量：
12
2
作者
孙自勇
陈均勇
+4 位作者
陈新园
汪晶
田鹏鹏
吴盛
刘建宁
《南京大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2004年第1期41-48,共8页
用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sephar...
用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.
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关键词
肠激酶
毕赤酵母
分泌表达
纯化
酶切
免疫印迹
丝氨酸蛋白水解酶
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职称材料
题名
丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用
被引量：
4
1
作者
李健蕊
武燕彬
司书毅
陈鸿珊
蒋建东
彭宗根
机构
中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所病毒室
出处
《中国医学科学院学报》
CAS
CSCD
北大核心
2011年第1期98-101,共4页
基金
科技部国际合作项目(2006DFA31450)
国家新药创制重大专项(2009ZX09302-004)
中央级公益性科研院所基本科研业务专项(IMBF-200902)~~
文摘
目的应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3-4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型。方法将质粒pMAL-c2/NS3-4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3-4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性。结果建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量。在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%。蛋白酶的Km值为4.74μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L。结论建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选。
关键词
丙型肝炎病毒
丝氨酸蛋白水解酶
高通量筛选模型
荧光共振能量转移
Keywords
hepatitis C virus
serine protease
high throughput screening
fluorescence resonance energy transfer
分类号
R373-33 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定
被引量：
12
2
作者
孙自勇
陈均勇
陈新园
汪晶
田鹏鹏
吴盛
刘建宁
机构
南京大学分子医学研究所
出处
《南京大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2004年第1期41-48,共8页
基金
国家重大科技专项"创新药物和中药现代化"(2002AA2Z3451)
文摘
用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.
关键词
肠激酶
毕赤酵母
分泌表达
纯化
酶切
免疫印迹
丝氨酸蛋白水解酶
Keywords
enterokinase (EK), secretory expression, digestion, Western blotting
分类号
Q556 [生物学—生物化学]
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用
李健蕊
武燕彬
司书毅
陈鸿珊
蒋建东
彭宗根
《中国医学科学院学报》
CAS
CSCD
北大核心
2011
4
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职称材料
2
牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定
孙自勇
陈均勇
陈新园
汪晶
田鹏鹏
吴盛
刘建宁
《南京大学学报（自然科学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2004
12
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