丙型肝炎病毒NS5A抑制剂的3D-QSAR研究

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作者 孟令鑫 刘蒙蒙 +1 位作者 王远强 林治华 《重庆理工大学学报（自然科学）》 CAS 2015年第5期52-60,F0003,共10页

丙型病毒性肝炎感染是输血后肝炎的主要病因之一。NS5A蛋白的小分子抑制剂显示出很强的体外抑制病毒生长的活性,并且初步的临床评价也证实了NS5A抑制剂能很好地抑制体内丙型肝炎病毒的生长。因此,研发高效的NS5A小分子抑制剂为治疗丙型... 丙型病毒性肝炎感染是输血后肝炎的主要病因之一。NS5A蛋白的小分子抑制剂显示出很强的体外抑制病毒生长的活性,并且初步的临床评价也证实了NS5A抑制剂能很好地抑制体内丙型肝炎病毒的生长。因此,研发高效的NS5A小分子抑制剂为治疗丙型肝炎提供了新的策略。进行了daclatasvir丙型肝炎病毒NS5A复制抑制剂的三维定量构效关系(3D-QSAR)研究,通过SYBYL-X 2.1.1分子模拟软件系统搜寻方法搜寻出化合物的最低能量构象,然后在Triops力场中用共轭梯度最小化进行优化。应用比较分子力场分析(Co MFA)和比较分子相似性指数分析(Co MSIA)进行分子活性构象的选择、分子叠合、建立空间场范围以及数据统计。用22个衍生物作为训练集建立模型,用6个衍生物作为测试集来验证模型的优劣。结果表明:Co MFA模的交叉相互验证系数q2=0.578,回归系数r2=0.939,Co MSIA模型的q2=0.584,r2=0.968。这些结论为丙型肝炎病毒NS5A复合体抑制剂的药物设计和筛选提供了理论依据。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒ns5a抑制剂 三维定量构效关系 比较分子场方法 比较分子相似 性指数分析法

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基于机器学习方法的丙型肝炎病毒聚合酶NS5B非核苷抑制剂的定量构效关系研究

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作者 丛湧 薛英 《物理化学学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2013年第8期1639-1647,共9页

对89个苯并异噻唑和苯并噻嗪类丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶非核苷抑制剂进行了定量构效关系(QSAR)研究.采用遗传算法组合偏最小二乘(GA-PLS)和线性逐步回归分析(LSRA)两种特征选择方法选择最优描述符子集,然后建立多元线性回归和偏最... 对89个苯并异噻唑和苯并噻嗪类丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶非核苷抑制剂进行了定量构效关系(QSAR)研究.采用遗传算法组合偏最小二乘(GA-PLS)和线性逐步回归分析(LSRA)两种特征选择方法选择最优描述符子集,然后建立多元线性回归和偏最小二乘线性回归模型.并首次尝试使用遗传算法耦合支持向量机方法(GA-SVM)对两种特征选择方法所选的描述符子集分别建立非线性支持向量机回归模型.三种机器学习方法所建模型均得到比较满意的预测效果.采用LSRA所选的6个描述符建立的三个QSAR模型对于测试集的相关系数为0.958-0.962,GA-SVM法给出最好的预测精度(0.962).采用GA-PLS所选的7个描述符建立的三个QSAR模型对于测试集的相关系数为0.918-0.960,偏最小二乘回归模型的结果最好(0.960).本工作提供了一种有效的方法来预测丙型肝炎病毒抑制剂的生物活性,该方法也可以扩展到其他类似的定量构效关系研究领域. 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒ns5B聚合酶 非核苷抑制剂 线性逐步回归分析 偏最小二乘法 遗传算法 支持向量机

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抑制丙型肝炎病毒NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义 被引量：1

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作者 苏秀芬 姜艳芳 +2 位作者 王峰 牛俊奇 唐彤宇 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期570-573,共4页

目的:构建抑制丙型肝炎病毒NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法:根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序... 目的:构建抑制丙型肝炎病毒NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法:根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后线性的pSilencerTM3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白表达。结果:对重新构建的pSilencerTM3.1-H1neoHCV NS5A-R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4 348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒NS5A蛋白在相对分子质量5 600处出现条带。结论:设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒ns5a基因 短发夹RNA RNA干扰

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究 被引量：43

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作者 刘妍 陆荫英 +3 位作者 成军 王建军 李莉 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期40-43,共4页

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染... 应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白ns5a 反式激活 基因 克隆化

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筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因 被引量：23

5

作者 王琳 李克 +7 位作者 成军 陆荫英 张键 刘妍 王刚 洪源 王贺 芮莉莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期50-52,共3页

细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的... 细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,作者采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 35个与NS5A特异性结合的阳性克隆 ,包括载脂蛋白、线粒体单体型基因、磷脂酸酸性磷酸酶等 11种已知功能蛋白质基因和 3个未知功能基因。 展开更多

关键词 筛选 克隆 丙型肝炎病毒 ns5a蛋白 结合蛋白 基因 酵母双杂交

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慢性丙型肝炎患者NS3/4A蛋白酶抑制剂预存耐药的临床研究 被引量：4

6

作者 李展翼 严颖 +2 位作者 刘莹 蔡庆贤 赵志新 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期437-441,448,共6页

【目的】了解我国华南地区从未接受任何抗病毒治疗的慢性丙型肝炎(慢丙肝)患者NS3/4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点的流行情况、临床特点包括其对干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗的影响。【方法】在接受抗病毒治疗前对183例慢丙肝患者的NS3/4... 【目的】了解我国华南地区从未接受任何抗病毒治疗的慢性丙型肝炎(慢丙肝)患者NS3/4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点的流行情况、临床特点包括其对干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗的影响。【方法】在接受抗病毒治疗前对183例慢丙肝患者的NS3/4A蛋白酶抑制剂相关的耐药位点采用自行设计型别特异性引物行巢式PCR,PCR产物纯化后直接测序法鉴定,有变异的患者为变异组(125例),无变异的患者为野生组(37例),对两组患者的临床资料包括干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒应答率等进行分析。【结果】183例患者中162例患者样本的NS3区扩增成功,其中125例(77.16%)患者检出耐药相关的变异位点266个,其中HCV 1b型A156S变异率为18.33%(11/60),T54S为5.00%(3/60);HCV 2a型V36L变异率为100.00%(14/14),A156S为64.29%(9/14);HCV 6a型Q80K变异率为95.45%(84/88),V36L为4.55%(4/88),D168E为2.27%(2/88),变异组患者经干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗后的持续病毒性应答率为81.60%(102/125),而野生组的为81.03%(30/37),两者比较无明显差异(P=0.943)。【结论】我国不同基因型的慢丙肝患者对NS3/4A蛋白酶抑制剂存在不同的预存耐药,耐药变异对慢丙肝患者疾病状态包括干扰素联合利巴韦林的疗效无影响。预存耐药的存在警示我们未来在使用此类药物时需分析病毒基因型及预存耐药变异情况,从而为患者提供最好的病毒学监测及最优的治疗方案。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 ns3/4A蛋白酶抑制剂 预存耐药 基因型

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基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型 被引量：8

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作者 张继明 尹有宽 +4 位作者 谢怡 卢清 张清波 邬祥惠 翁心华 《中国抗感染化疗杂志》 2003年第5期287-290,共4页

目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT P... 目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和套式 PCR扩增HCVRNA阳性的 4 1份标本的部分HCVNS5B区基因 ,PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载 2 5份不同基因型的HCV原型序列 ,用NS5B区 2 2 2bp的基因片段构建系统进化树 ,对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果 :基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析 ,可成功地对本组 4 1份标本进行基因分型。分型结果显示 ,1b型占 85 .4 % (35 / 4 1) ,2a型占 12 .2 0 % (5 / 4 1) ,3a型占 2 .4 4 % (1/ 4 1)。结论 :基于HCVNS5B区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 基因型 系统进化树分析 ns5B基因 基因序列分析 基因分型

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丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析 被引量：2

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作者 孔令保 刘志文 +2 位作者 吴晓玉 刘好桔 王园秀 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期54-56,共3页

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检... 目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 ns5B HEP3B细胞 活性

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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选 被引量：2

9

作者 张连峰 李继昌 +2 位作者 韩莉 成军 陈立东 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第4期638-641,共4页

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转... 目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与细胞基因表达及恶性转化相关的蛋白质编码基因,为HCVNS5A可能存在的调控机制提供新的线索。 展开更多

关键词 抑制性消减杂交 丙型肝炎病毒 ns5aTP1基因 反式调节

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丙型肝炎病毒5’-非编码区与NS 5b区酶切分型对比研究 被引量：1

10

作者 许青田 李新月 +2 位作者 熊飞升 杜绍财 陶其敏 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2003年第1期20-21,共2页

探讨北京与河南地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况以及HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域分型结果之间的差异。对56例慢性丙型肝炎和80例有偿供血员的HCV RNA阳性血清。同时进行HCV 5’-NCR和HCV NS5b酶切分型研究。HCV 5’-NCR和HCV NS5... 探讨北京与河南地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况以及HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域分型结果之间的差异。对56例慢性丙型肝炎和80例有偿供血员的HCV RNA阳性血清。同时进行HCV 5’-NCR和HCV NS5b酶切分型研究。HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域的Ⅱ/1b型感染率北京地区分别占85.7％和87.5％,河南地区分别占68.8％和70.0％。HCV Ⅱ/lb型为北京和河南地区HCV感染的优势株,同时HCV 5’-NCR和HCV NS5b区酶切分型结果间具有良好的相互对应关系。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 HCV 基因型 5’-NCR区 ns5b区 HCVⅡ/1b型 酶切分型 北京 河南

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丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3-5B蛋白的真核表达载体构建及其在BHK-21细胞中的表达 被引量：1

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作者 韩佩君 雷迎峰 +5 位作者 吕欣 杨敬 姚敏 乔卿华 党品香 尹文 《科学技术与工程》 北大核心 2013年第36期10794-10797,10805,共5页

通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达载体... 通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-NS3-5b,并且NS3/4A蛋白和NS5B蛋白得到特异性表达,为下一步建立HCV RdRp活性的细胞评价系统和动物模型评价系统奠定了实验和理论基础。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒(hepatitis e virus HCV) ns3-5B蛋白 真核表达

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丙型肝炎病毒非结构蛋白3蛋白酶抑制剂的研究进展 被引量：3

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作者 许小亮 李君武 《医学研究生学报》 CAS 2005年第10期930-933,共4页

面对丙型肝炎的流行,至今缺少理想的治疗药物和方案,丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(NS3)蛋白酶是近年来抗丙型肝炎药物研究的重要靶点。作者综述了NS3蛋白酶抑制剂的作用机制和活性特点。

关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白 蛋白酶抑制剂

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TNF-α抑制剂在细胞水平上抑制丙型肝炎病毒的感染 被引量：1

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作者 刘媛 王文博 +5 位作者 邹自英 朱冰 弓超 曹雪峰 胡宗海 熊杰 《重庆医科大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第11期1488-1493,共6页

目的:探索TNF-α抑制剂对丙型肝炎病毒感染肝细胞的影响。方法:体外培养肝癌细胞株Huh7细胞,分为未处理组、NFκB抑制剂[6-amino-4-(4-phenoxyphenylethylamino)quinazoline,QNZ]处理组、咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CA... 目的:探索TNF-α抑制剂对丙型肝炎病毒感染肝细胞的影响。方法:体外培养肝癌细胞株Huh7细胞,分为未处理组、NFκB抑制剂[6-amino-4-(4-phenoxyphenylethylamino)quinazoline,QNZ]处理组、咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)处理组和TNF-α抑制剂来那度胺(Lenalidomide)处理组,每组设置浓度梯度为100μmol/L至1.28 nmol/L,5倍倍比稀释,通过CCK8法检测各抑制剂对细胞增殖的影响;Huh7细胞经抑制剂处理后,再以丙型肝炎病毒感染,通过荧光定量PCR和免疫荧光法检测细胞内病毒的感染水平。结果:100μmol/L QNZ处理组(0.730±0.056)和100μmol/L CAPE处理组(1.040±0.014)细胞在450 nm处的吸光度(absorbance,A)值均低于未处理组(1.190±0.040,P=0.000)。Lenalidomide各浓度处理组(100μmol/L处理组,1.250±0.016)细胞增殖水平与未处理组相当(P=0.306)。在抗病毒活性方面,100 nmol/L Lenalidomide处理组[(3.79±0.88)×105]和QNZ处理组[(6.64±1.11)×105]HCV RNA水平明显低于未处理组[(1.51±0.45)×10~6,P=0.000],而CAPE处理组[(1.61±0.15)×10~6]与未处理组HCV RNA水平相当(P=0.383)。结论:TNF-α抑制剂Lenalidomide对细胞毒性较小,能够在细胞水平上抑制丙型肝炎病毒的感染。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 TNF-α抑制剂:抗病毒活性

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丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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作者 付慧 楚雍烈 +4 位作者 张丽莉 曹美茹 成凡 茹小荣 王勇健 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期376-379,398,共5页

目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出约480 bp的目的片段,将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,... 目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出约480 bp的目的片段,将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再亚克隆到原核表达载体pET-28a中;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达;采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体,并得以表达。结论成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 ns5a基因 基因表达

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丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆以及在原核和昆虫细胞中表达的研究

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作者 梁昌镛 He Bin +2 位作者 胡志红 王汉中 陈新文 《华中师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期236-241,共6页

克隆了丙型肝炎病毒的NS5A基因,并在细菌和昆虫两种不同的系统中成功地进行了该基因的表达.利用PCR方法获得了NS5A完整的编码区并克隆到原核表达载体pGEX-KG上,在大肠杆菌中诱导表达了78kDa的NS5A与GST的融合蛋白.同时发现,融合蛋白被... 克隆了丙型肝炎病毒的NS5A基因,并在细菌和昆虫两种不同的系统中成功地进行了该基因的表达.利用PCR方法获得了NS5A完整的编码区并克隆到原核表达载体pGEX-KG上,在大肠杆菌中诱导表达了78kDa的NS5A与GST的融合蛋白.同时发现,融合蛋白被部分切割为50kDa的NS5A和28kDa的GST.在原核细胞中表达的78kDa和50kDa两种蛋白均具有较高的免疫原性,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清.另外,利用两种昆虫表达系统,即AcMN-PV和HaSNPV的Bac-to-Bac系统对NS5A进行了表达,表达产物为58kDa. 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 ns5a基因 基因克隆 原核细胞 昆虫细胞 基因表达 免疫原性

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丙型肝炎病毒NS5B基因的克隆及在大肠杆菌的分泌表达 被引量：5

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作者 张跃红 段惠娟 鞠连才 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第8期696-698,共3页

由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性 ,其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B ,作者对NS5B进行截短 ,缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCVNS5B基因 ,并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)的方法 ,设计截去NS5B疏水... 由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性 ,其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B ,作者对NS5B进行截短 ,缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCVNS5B基因 ,并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)的方法 ,设计截去NS5B疏水部分 ,PCR引物以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板 ,克隆到pGEM Teasy载体中 ,双酶切后回收连接到pET 2 1b中表达。大肠杆菌培养上清过柱纯化 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析 ,并用液闪近端分析 (SPA)法分析NS5BRdRp活性。成功地构建了NS5B基因大肠杆菌表达载体 ,Western免疫印迹显示NS5B蛋白在大肠杆菌细胞中表达。表达产物在大肠杆菌培养上清中存在 ,分子量 6 8kD左右 ,而且 [3 H]总掺入率达 6 90 0cpm。NS5B蛋白在大肠杆菌上清中表达成功 ,经过活性测定 。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 ns5B基因 大肠杆菌 基因表达 逆转录多聚酶链反应

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“双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒NS_5基因 被引量：2

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作者 李庆生 郭建平 陶其敏 《生物化学杂志》 CSCD 1996年第2期249-251,共3页

“双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＮＳ_５基因李庆生，郭建平，陶其敏（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）我们在扩增丙型肝炎病毒ＮＳ５基因中，探讨了退火温度与扩增产物特异性之间的关系，发现“双退... “双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＮＳ_５基因李庆生，郭建平，陶其敏（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）我们在扩增丙型肝炎病毒ＮＳ５基因中，探讨了退火温度与扩增产物特异性之间的关系，发现“双退火温度”多聚酶链反应可很好地解决目?.. 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 ns5基因 聚合酶链反应

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丙型肝炎病毒NS_5区基因片段的克隆与表达 被引量：2

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作者 刘双虎 谭德明 +2 位作者 胡国龄 张铮 任培上 《湖南医科大学学报》 CSCD 1996年第3期242-244,共3页

应用ＲＴ一ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区ＨＣＶ感染者血清中获得ＨＣＶＮＳ＿５区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析，此克隆片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。应用ＰＭＡＬ－ＣＲＩ质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段，并获融合蛋白... 应用ＲＴ一ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区ＨＣＶ感染者血清中获得ＨＣＶＮＳ＿５区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析，此克隆片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。应用ＰＭＡＬ－ＣＲＩ质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段，并获融合蛋白ＭＢＰ－ＨＣＶ·ＮＳ＿５，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实该融合蛋白有较特异的ＨＣＶ抗原性，可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机制的研究。 展开更多

关键词 丙型肝炎病毒 基因克隆 基因表达 ns5区

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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究 被引量：2

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作者 王琳 李克 +7 位作者 成军 张健 邵清 梁耀东 陈天艳 刘妍 钟彦伟 洪源 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第9期771-773,I001,共4页

丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合 ,涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因 ,命名为NS5ABP37,根据G... 丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合 ,涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因 ,命名为NS5ABP37,根据Gen Bank数据库推定蛋白编码序列的信息 ,应用反转录聚合酶链反应 (PCR)扩增出该基因序列。连接入酵母和真核细胞表达载体表达成功 ,并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用 ,为进一步研究奠定基础。 展开更多

关键词 基因克隆化 丙型肝炎病毒ns5a 酵母双杂交

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丙型肝炎病毒NS5A蛋白功能的研究进展

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作者 周友乾 尹凤鸣 冯经华 《临床肝胆病杂志》 CAS 2009年第2期148-151,共4页

关键词 丙型肝炎病毒ns5a 蛋白功能 非结构蛋白 包膜蛋白E1 开放阅读框 HCV 肝脏疾病 感染人数

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