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抑制丙型肝炎病毒NS5A基因表达的shRNA系统的构建及意义 被引量：1
1
作者 苏秀芬 姜艳芳 +2 位作者 王峰 牛俊奇 唐彤宇 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期570-573,共4页
目的:构建抑制丙型肝炎病毒NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法:根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序... 目的:构建抑制丙型肝炎病毒NS5A基因(HCV NS5A)表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,观察其对HCV NS5A蛋白表达的抑制作用。方法:根据HCV NS5A基因已知序列,设计3段19个碱基的HCV NS5A特异性靶序列,合成两对63 bp并含有编码shRNA序列的寡核苷酸,双链退火后,克隆到经过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后线性的pSilencerTM3.1-H1neo载体的H1启动子下游,重组构建RNA干扰(RNAi)质粒,进行电泳,将3个不同的RNAi质粒和阴性对照质粒分别与HCV NS5A真核表达质粒共转染正常肝细胞HL-7702细胞系,用Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白表达。结果:对重新构建的pSilencerTM3.1-H1neoHCV NS5A-R1、R2、R3质粒进行测序,与设计的序列完全相同;3个质粒电泳均在4 348 bp处出现特异性条带;Western blotting印迹法测得R1、R2和R3的NS5A蛋白未见明显条带,阴性对照质粒NS5A蛋白在相对分子质量5 600处出现条带。结论:设计合成的3个不同位点的63个碱基均成功插入到预计位点,并且序列完全正确,对HCV NS5A基因表达有特异性抑制作用。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒ns5a基因 短发夹RNA RNA干扰
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丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建 被引量：1
2
作者 苏秀芬 牛俊奇 +1 位作者 姜艳芳 胡玉琳 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期44-46,共3页
目的:构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法:用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1(+)/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM10... 目的:构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法:用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1(+)/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果:用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论:成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。 展开更多
关键词 真核表达载体 ns5a基因 肝炎病毒 丙型
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丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆以及在原核和昆虫细胞中表达的研究
3
作者 梁昌镛 He Bin +2 位作者 胡志红 王汉中 陈新文 《华中师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期236-241,共6页
克隆了丙型肝炎病毒的NS5A基因,并在细菌和昆虫两种不同的系统中成功地进行了该基因的表达.利用PCR方法获得了NS5A完整的编码区并克隆到原核表达载体pGEX-KG上,在大肠杆菌中诱导表达了78kDa的NS5A与GST的融合蛋白.同时发现,融合蛋白被... 克隆了丙型肝炎病毒的NS5A基因,并在细菌和昆虫两种不同的系统中成功地进行了该基因的表达.利用PCR方法获得了NS5A完整的编码区并克隆到原核表达载体pGEX-KG上,在大肠杆菌中诱导表达了78kDa的NS5A与GST的融合蛋白.同时发现,融合蛋白被部分切割为50kDa的NS5A和28kDa的GST.在原核细胞中表达的78kDa和50kDa两种蛋白均具有较高的免疫原性,通过免疫家兔获得了高特异性的兔抗血清.另外,利用两种昆虫表达系统,即AcMN-PV和HaSNPV的Bac-to-Bac系统对NS5A进行了表达,表达产物为58kDa. 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 ns5a基因 基因克隆 原核细胞 昆虫细胞 基因表达 免疫原性
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究 被引量：43
4
作者 刘妍 陆荫英 +3 位作者 成军 王建军 李莉 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期40-43,共4页
应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染... 应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白ns5a 反式激活 基因 克隆化
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筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因 被引量：23
5
作者 王琳 李克 +7 位作者 成军 陆荫英 张键 刘妍 王刚 洪源 王贺 芮莉莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期50-52,共3页
细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的... 细胞内蛋白 蛋白的结合是丙型肝炎病毒 (HCV)与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白 5A(NS5A)被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子 ,参与HCV的复制、转录和信号传导等过程 ,但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,作者采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 35个与NS5A特异性结合的阳性克隆 ,包括载脂蛋白、线粒体单体型基因、磷脂酸酸性磷酸酶等 11种已知功能蛋白质基因和 3个未知功能基因。 展开更多
关键词 筛选 克隆 丙型肝炎病毒 ns5a蛋白 结合蛋白 基因 酵母双杂交
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基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型 被引量：8
6
作者 张继明 尹有宽 +4 位作者 谢怡 卢清 张清波 邬祥惠 翁心华 《中国抗感染化疗杂志》 2003年第5期287-290,共4页
目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT P... 目的 :建立基于丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法 ,对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法 :用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患者血清标本的HCVRNA水平进行定量分析。用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)和套式 PCR扩增HCVRNA阳性的 4 1份标本的部分HCVNS5B区基因 ,PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载 2 5份不同基因型的HCV原型序列 ,用NS5B区 2 2 2bp的基因片段构建系统进化树 ,对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果 :基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析 ,可成功地对本组 4 1份标本进行基因分型。分型结果显示 ,1b型占 85 .4 % (35 / 4 1) ,2a型占 12 .2 0 % (5 / 4 1) ,3a型占 2 .4 4 % (1/ 4 1)。结论 :基于HCVNS5B区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 基因型 系统进化树分析 ns5B基因 基因序列分析 基因分型
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丙型肝炎病毒NS5b区酶切基因分型及其在干扰素治疗中的应用 被引量：3
7
作者 许青田 杜绍财 +3 位作者 季颖 王会民 李新月 陶其敏 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2001年第4期231-232,共2页
探讨丙型肝炎病毒 (HCV)感染的基因型及其与干扰素应答效果的关系。应用逆转录 -聚合酶链反应(RT -PCR)技术对 2 6 9例肝炎患者血清进行HCVNS5b区基因片段扩增 ,并对 5 6例阳性PCR产物进行酶切分型 ,同时观察干扰素α - 2b对其中 48例... 探讨丙型肝炎病毒 (HCV)感染的基因型及其与干扰素应答效果的关系。应用逆转录 -聚合酶链反应(RT -PCR)技术对 2 6 9例肝炎患者血清进行HCVNS5b区基因片段扩增 ,并对 5 6例阳性PCR产物进行酶切分型 ,同时观察干扰素α - 2b对其中 48例慢性丙型肝炎的疗效。HCV单纯 1b型感染、1b基因变异及 2a型感染对干扰素的应答率分别为 70 % (14/ 2 0 )、9 5 % (2 / 2 1)、71 4% (5 / 7) ;其中完全应答分别为 45 % (9/ 2 0 )、4 8% (1/ 2 1)、5 7 1% (4/ 7) ;部分应答分别为 2 5 % (5 / 2 0 )、4 8% (1/ 2 1)、14 3 % (1/ 7)。 1b基因变异组同单纯 1b型及 2a型感染组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ,而单纯 1b型感染组与 2a型感染组比较无明显差异 (P >0 0 5 )。HCV单纯 1b型感染或 2a型感染者对干扰素敏感 ,而 1b基因变异者干扰素治疗效果极差 ,可作为预测干扰素疗效的一项新的重要指标。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 基因分型 聚合酶链反应 干扰素 ns56区酶切分型
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究 被引量：2
8
作者 刘妍 杨倩 +5 位作者 成军 王建军 纪冬 王春花 党晓燕 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期383-385,共3页
目的　筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法　以HCVNS5A表达质粒pcD NA3.1( ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所... 目的　筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法　以HCVNS5A表达质粒pcD NA3.1( ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中有新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcD NA3.1( ) NS5A的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果　该新基因的编码序列全长为 15 72nt,编码产物由 5 2 4aa组成 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP3,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 936 4。结论　分子生物学技术与生物信息学技术相结合 ,发现并鉴定、克隆了HCVNS5A反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3。 展开更多
关键词 肝炎病毒 丙型 非结构蛋白ns5a 反式激活 基因克隆化
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选 被引量：2
9
作者 张连峰 李继昌 +2 位作者 韩莉 成军 陈立东 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第4期638-641,共4页
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转... 目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与细胞基因表达及恶性转化相关的蛋白质编码基因,为HCVNS5A可能存在的调控机制提供新的线索。 展开更多
关键词 抑制性消减杂交 丙型肝炎病毒 ns5aTP1基因 反式调节
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丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：2
10
作者 郑铁龙 成军 +2 位作者 洪源 李晓光 张延峰 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期59-61,共3页
目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-NS5ATP1表达载体,... 目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a(+)-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a(+)-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 肝炎病毒 丙型 ns5aTP1基因 原核表达
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丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
11
作者 付慧 楚雍烈 +4 位作者 张丽莉 曹美茹 成凡 茹小荣 王勇健 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期376-379,398,共5页
目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出约480 bp的目的片段,将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,... 目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出约480 bp的目的片段,将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再亚克隆到原核表达载体pET-28a中;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达;采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体,并得以表达。结论成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 ns5a基因 基因表达
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丙型肝炎病毒NS5B基因的克隆及在大肠杆菌的分泌表达 被引量：5
12
作者 张跃红 段惠娟 鞠连才 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第8期696-698,共3页
由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性 ,其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B ,作者对NS5B进行截短 ,缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCVNS5B基因 ,并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)的方法 ,设计截去NS5B疏水... 由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性 ,其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B ,作者对NS5B进行截短 ,缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCVNS5B基因 ,并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)的方法 ,设计截去NS5B疏水部分 ,PCR引物以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板 ,克隆到pGEM Teasy载体中 ,双酶切后回收连接到pET 2 1b中表达。大肠杆菌培养上清过柱纯化 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析 ,并用液闪近端分析 (SPA)法分析NS5BRdRp活性。成功地构建了NS5B基因大肠杆菌表达载体 ,Western免疫印迹显示NS5B蛋白在大肠杆菌细胞中表达。表达产物在大肠杆菌培养上清中存在 ,分子量 6 8kD左右 ,而且 [3 H]总掺入率达 6 90 0cpm。NS5B蛋白在大肠杆菌上清中表达成功 ,经过活性测定 。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 ns5B基因 大肠杆菌 基因表达 逆转录多聚酶链反应
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“双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒NS_5基因 被引量：2
13
作者 李庆生 郭建平 陶其敏 《生物化学杂志》 CSCD 1996年第2期249-251,共3页
“双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＮＳ_５基因李庆生，郭建平，陶其敏（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）我们在扩增丙型肝炎病毒ＮＳ５基因中，探讨了退火温度与扩增产物特异性之间的关系，发现“双退... “双退火温度”多聚酶链反应扩增丙型肝炎病毒ＮＳ_５基因李庆生，郭建平，陶其敏（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）我们在扩增丙型肝炎病毒ＮＳ５基因中，探讨了退火温度与扩增产物特异性之间的关系，发现“双退火温度”多聚酶链反应可很好地解决目?.. 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 ns5基因 聚合酶链反应
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酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因 被引量：15
14
作者 李克 王琳 +4 位作者 成军 陆荫英 洪源 刘妍 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期31-33,共3页
为克隆与丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因 ,采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCVNS3蛋白诱饵酵母质粒 ,转化酵母AH10 9后与含文库质粒的酵母Y187进行配合 ,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在 4... 为克隆与丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因 ,采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCVNS3蛋白诱饵酵母质粒 ,转化酵母AH10 9后与含文库质粒的酵母Y187进行配合 ,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在 4重营养缺陷培养基(SD/ Trp Leu Ade His)上生长 ,又能在涂有X α 半乳糖(X α gal)的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落 ,提取此酵母克隆的质粒 ,转化大肠杆菌后进行测序 ,并进行生物信息学分析。分析的结果显示 ,筛选出 19个阳性克隆 ,包括已知功能基因 17个 ,还有 1个克隆的测序结果与GenBank中的 1个未知功能序列有 4 4 %的同源性 ,初步证明了此基因与HCVNS3有结合活性。说明成功克隆了HCVNS3蛋白结合蛋白基因 ,为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。 展开更多
关键词 酵母双杂交技术 筛选 克隆 丙型肝炎病毒 ns3结合蛋白基因
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丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3CE对番茄的遗传转化 被引量：5
15
作者 李轶女 张中林 +3 位作者 苏宁 孙萌 倪丕冲 沈桂芳 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期360-363,共4页
丙型肝炎病毒是危害人类健康重要的病源之一 ,研制安全、经济、有效和易于推广使用的抗病毒疫苗是预防和控制 HCV的有效手段。本实验用 PCR方法克隆了 HCV中能够产生中和性抗体、具有很好免疫原性的非结构 N S3区基因片段及核心抗原 CE... 丙型肝炎病毒是危害人类健康重要的病源之一 ,研制安全、经济、有效和易于推广使用的抗病毒疫苗是预防和控制 HCV的有效手段。本实验用 PCR方法克隆了 HCV中能够产生中和性抗体、具有很好免疫原性的非结构 N S3区基因片段及核心抗原 CE基因片段 ,并在两段基因之间加入连接肽 SPGS的密码子序列 ,构建成融合抗原基因 N S3- CE。将该融合基因连接到载体 p BI12 1上 ,构建植物表达载体 p BINS3CE。通过根癌农杆菌 EHA10 5介导获得转基因番茄。并进行了 PCR扩增、Southern杂交及 RT- PCR等分子检测 ,结果证明外源基因已整合到转基因番茄的基因组中 ,并在转录水平得到表达。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 融合抗原基因 ns3CE 番茄 遗传转化 转基因番茄
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究 被引量：2
16
作者 王琳 李克 +7 位作者 成军 张健 邵清 梁耀东 陈天艳 刘妍 钟彦伟 洪源 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第9期771-773,I001,共4页
丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合 ,涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因 ,命名为NS5ABP37,根据G... 丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合 ,涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因 ,命名为NS5ABP37,根据Gen Bank数据库推定蛋白编码序列的信息 ,应用反转录聚合酶链反应 (PCR)扩增出该基因序列。连接入酵母和真核细胞表达载体表达成功 ,并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用 ,为进一步研究奠定基础。 展开更多
关键词 基因克隆化 丙型肝炎病毒ns5a 酵母双杂交
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丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析 被引量：2
17
作者 孔令保 刘志文 +2 位作者 吴晓玉 刘好桔 王园秀 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期54-56,共3页
目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检... 目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 ns5B HEP3B细胞 活性
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丙型肝炎病毒NS_5区基因片段的克隆与表达 被引量：2
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作者 刘双虎 谭德明 +2 位作者 胡国龄 张铮 任培上 《湖南医科大学学报》 CSCD 1996年第3期242-244,共3页
应用ＲＴ一ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区ＨＣＶ感染者血清中获得ＨＣＶＮＳ＿５区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析，此克隆片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。应用ＰＭＡＬ－ＣＲＩ质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段，并获融合蛋白... 应用ＲＴ一ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区ＨＣＶ感染者血清中获得ＨＣＶＮＳ＿５区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析，此克隆片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。应用ＰＭＡＬ－ＣＲＩ质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段，并获融合蛋白ＭＢＰ－ＨＣＶ·ＮＳ＿５，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实该融合蛋白有较特异的ＨＣＶ抗原性，可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机制的研究。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 基因克隆 基因表达 ns5区
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丙型肝炎病毒5’-非编码区与NS 5b区酶切分型对比研究 被引量：1
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作者 许青田 李新月 +2 位作者 熊飞升 杜绍财 陶其敏 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2003年第1期20-21,共2页
探讨北京与河南地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况以及HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域分型结果之间的差异。对56例慢性丙型肝炎和80例有偿供血员的HCV RNA阳性血清。同时进行HCV 5’-NCR和HCV NS5b酶切分型研究。HCV 5’-NCR和HCV NS5... 探讨北京与河南地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况以及HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域分型结果之间的差异。对56例慢性丙型肝炎和80例有偿供血员的HCV RNA阳性血清。同时进行HCV 5’-NCR和HCV NS5b酶切分型研究。HCV 5’-NCR和HCV NS5b两区域的Ⅱ/1b型感染率北京地区分别占85.7％和87.5％,河南地区分别占68.8％和70.0％。HCV Ⅱ/lb型为北京和河南地区HCV感染的优势株,同时HCV 5’-NCR和HCV NS5b区酶切分型结果间具有良好的相互对应关系。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 HCV 基因型 5’-NCR区 ns5b区 HCVⅡ/1b型 酶切分型 北京 河南
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丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3-5B蛋白的真核表达载体构建及其在BHK-21细胞中的表达 被引量：1
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作者 韩佩君 雷迎峰 +5 位作者 吕欣 杨敬 姚敏 乔卿华 党品香 尹文 《科学技术与工程》 北大核心 2013年第36期10794-10797,10805,共5页
通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达载体... 通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-NS3-5b,并且NS3/4A蛋白和NS5B蛋白得到特异性表达,为下一步建立HCV RdRp活性的细胞评价系统和动物模型评价系统奠定了实验和理论基础。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒(hepatitis e virus HCV) ns3-5B蛋白 真核表达
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