猪圆环病毒2型不对称PCR检测方法的建立 被引量：4

1

作者 杨泽晓 韩雪清 +4 位作者 王印 姚学萍 杨增岐 张彦明 汪开毓 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第2期1-5,共5页

为研究制备单链DNA的方法,根据GenBank已发表的PCV-2全基因组序列,设计合成2条特异性引物和1条通用引物,通过pGM-T-PCV-2重组质粒的构建、引物浓度优化、单链PCR产物的杂交测序鉴定,以及敏感性和特异性试验,对PCV-2不对称PCR方法进行了... 为研究制备单链DNA的方法,根据GenBank已发表的PCV-2全基因组序列,设计合成2条特异性引物和1条通用引物,通过pGM-T-PCV-2重组质粒的构建、引物浓度优化、单链PCR产物的杂交测序鉴定,以及敏感性和特异性试验,对PCV-2不对称PCR方法进行了研究。结果显示,上、下游引物用量比为20∶1～40∶1时,可明显扩增出457 bp大小的单链和双链特异性目的片段,不对称PCR敏感性和对称PCR相一致,CSFV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。PCV-2不对称PCR方法的建立,为基因芯片制备的相关研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 不对称pcr 方法建立

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分子信标用于不对称PCR检测乙型肝炎病毒 被引量：4

2

作者 孔德明 蒋海燕 +1 位作者 沈含熙 宓怀风 《分析测试学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期7-10,共4页

为了缓解竞争杂交对分子信标检测的影响, 将分子信标与不对称聚合酶链式反应(PCR)联用进行血清中乙型肝炎病毒(HBV)的检测。并采用更为直接的荧光方法, 将不对称PCR扩增中的引物浓度比确定为5∶1, 该结果与电泳方法得到的结果有所不同... 为了缓解竞争杂交对分子信标检测的影响, 将分子信标与不对称聚合酶链式反应(PCR)联用进行血清中乙型肝炎病毒(HBV)的检测。并采用更为直接的荧光方法, 将不对称PCR扩增中的引物浓度比确定为5∶1, 该结果与电泳方法得到的结果有所不同。文中结合对称及不对称PCR过程中荧光强度的变化情况, 对其原因进行了详细的探讨。分子信标与不对称PCR联用, 可以专一地检测出血清中HBV的存在, 与分子信标/对称PCR相比, 其检测效果明显增强。 展开更多

关键词 分子信标 不对称pcr 乙型肝炎病毒(HBV)

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通用多重不对称PCR结合寡核苷酸芯片检测7种食源性致病菌 被引量：4

3

作者 王小强 袁军 +1 位作者 韩锐郡 营思思 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第8期290-295,共6页

应用通用多重不对称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和寡核酸芯片技术建立一种同时检测7种常见食源性致病菌的方法。每种致病菌上游或下游引物5’端连接一段异源的共有序列。以荧光标记的该共有序列作为通用引物,与限制... 应用通用多重不对称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和寡核酸芯片技术建立一种同时检测7种常见食源性致病菌的方法。每种致病菌上游或下游引物5’端连接一段异源的共有序列。以荧光标记的该共有序列作为通用引物,与限制性特异引物经一步多重不对称PCR同时获得所有目标菌的单链标记靶序列,可被芯片上固定的特异性寡核苷酸探针捕获。通过芯片扫描、分析荧光信号完成检测。标准菌株检测结果证实,该方法可特异地检测单一和混合感染的目标菌,基因组DNA的检测灵敏度为0.1~1 pg。95份模拟污染和零售食品样本芯片检测结果与常规的分离与生化鉴定及荧光定量PCR结果一致。建立的寡核苷酸芯片方法可为快速、特异、灵敏及高通量地鉴定食源性致病菌提供一种有效的检测手段。 展开更多

关键词 食源性致病菌 通用引物 多重不对称pcr 寡核苷酸芯片

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不对称PCR技术及其在食源性致病菌检测中应用的研究进展 被引量：7

4

作者 李凡 许恒毅 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期379-383,共5页

不对称PCR技术是获取单链DNA的一种重要方法。将不对称PCR技术与常用核酸检测方法结合,具有较高的灵敏度和较强的特异性,已被广泛应用食源性致病菌检测中。本文对不对称PCR技术进行简介,综述近年来其在食源性致病菌检测中的应用概况,并... 不对称PCR技术是获取单链DNA的一种重要方法。将不对称PCR技术与常用核酸检测方法结合,具有较高的灵敏度和较强的特异性,已被广泛应用食源性致病菌检测中。本文对不对称PCR技术进行简介,综述近年来其在食源性致病菌检测中的应用概况,并对其存在的问题进行了简单阐述。 展开更多

关键词 不对称pcr技术 食源性致病菌 检测

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利用交错式热不对称PCR法获取多脊椎蒙古羊Hoxc8启动子序列的研究 被引量：2

5

作者 陈琦 赵静 +1 位作者 张立岭 马月辉 《安徽农业科学》 CAS 2012年第3期1511-1513,1516,共4页

[目的]探索获得蒙古羊Hoxc8基因启动子序列的方法。[方法]尝试利用交错式热不对称PCR法,获得蒙古羊Hoxc8启动子序列。[结果]通过PCR获得的序列不理想,测序结果无法与已知序列相匹配。虽然利用交错式热不对称PCR法未获得蒙古羊的Hoxc8的... [目的]探索获得蒙古羊Hoxc8基因启动子序列的方法。[方法]尝试利用交错式热不对称PCR法,获得蒙古羊Hoxc8启动子序列。[结果]通过PCR获得的序列不理想,测序结果无法与已知序列相匹配。虽然利用交错式热不对称PCR法未获得蒙古羊的Hoxc8的启动子序列,但可为今后的相关研究提供借鉴。[结论]该研究为进一步分析蒙古羊Hoxc8的启动子区域的甲基化状态奠定了基础。 展开更多

关键词 Hoxc8 exon-1 多脊椎蒙古羊 染色体步移技术 交错式热不对称pcr法 启动子

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应用不对称竞争性PCR技术确定藏羊Agouti基因拷贝重复数 被引量：2

6

作者 杨树猛 岳耀敬 +5 位作者 杨博辉 郭健 孙晓萍 牛春娥 冯瑞林 郭婷婷 《中国草食动物》 2011年第5期5-8,共4页

实验采用不对称竞争性PCR技术,测定16只不同毛色藏羊Agouti基因的拷贝重复数,对记录所得Agouti基因连接点的比值进行分析。对样品（n=16）的Agouti基因拷贝数进行分析,区分未知样品Agouti基因的拷贝数。10只全白藏羊的拷贝数在3-6个之间... 实验采用不对称竞争性PCR技术,测定16只不同毛色藏羊Agouti基因的拷贝重复数,对记录所得Agouti基因连接点的比值进行分析。对样品（n=16）的Agouti基因拷贝数进行分析,区分未知样品Agouti基因的拷贝数。10只全白藏羊的拷贝数在3-6个之间,其余不同毛色6只藏羊均为2个拷贝数。实验证明：不对称竞争性PCR技术检测Agouti基因拷贝重复数变异的方法,可以直接对产物进行定量,具有良好的稳定性和特异性,而且操作简单、安全,自动化程度高,不易产生污染,不需昂贵设备,适合在普通实验室检测。 展开更多

关键词 不对称竞争性pcr 藏羊 Agouti基因 拷贝重复数

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TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列 被引量：2

7

作者 刘礼辉 李宁求 +1 位作者 石存斌 吴淑勤 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第32期18074-18076,共3页

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)扩增菌株M165的aroA... [目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)扩增菌株M165的aroA基因序列,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1 230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。 展开更多

关键词 热不对称pcr 烂鳃病 约氏黄杆菌 aroA基因

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利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析 被引量：3

8

作者 戴宝新 冯惠勇 +3 位作者 李天明 刘天佳 刘静文 仪宏 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第1期194-198,共5页

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板，基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物，通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全长基因（gdh），并对其序列进行生物信息学分析。结果... 以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板，基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物，通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）的全长基因（gdh），并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2 268 bp，编码755个氨基酸，其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72 ku，pI值约为5.14；GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成；GDH N末端的AA 1～140区域有5个跨膜结构域。 展开更多

关键词 葡萄糖酸 交错式热不对称pcr 弱氧化醋酸杆菌 葡萄糖脱氢酶 生物信息学

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TAIL-PCR的技术改良及对香蕉NBS-RGC5基因侧翼序列的克隆 被引量：2

9

作者 罗静瑶 陈云云 +3 位作者 谢俊 韦双双 夏幽泉 汤华 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期143-145,170,共4页

香蕉枯萎病是一种毁灭性真菌病害,对香蕉的种植和产业发展危害严重,研究香蕉枯萎病相关的抗性基因,具有重要的理论意义。对TAIL-PCR进行技术改良,以简并引物组合的方式与特异性引物进行扩增,代替最初的单一简并引物方式,在TAIL-PCR第一... 香蕉枯萎病是一种毁灭性真菌病害,对香蕉的种植和产业发展危害严重,研究香蕉枯萎病相关的抗性基因,具有重要的理论意义。对TAIL-PCR进行技术改良,以简并引物组合的方式与特异性引物进行扩增,代替最初的单一简并引物方式,在TAIL-PCR第一轮扩增的大循环中设置不同的退火温度;采用改良后的TAIL-PCR成功克隆了巴西蕉NBS型抗性蛋白(NBS-RGC5)基因的侧翼序列。 展开更多

关键词 香蕉 枯萎病 热不对称交错pcr(TAIL-pcr) NBS-RGC5 侧翼序列

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应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列 被引量：2

10

作者 魏跃 陈啸寅 +1 位作者 王全智 陈劲枫 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第5期900-904,共5页

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenasegene,6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer ... 运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenasegene,6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。 展开更多

关键词 热不对称交错pcr 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 黄瓜 上游序列

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红色原鸡IFN-γ基因的克隆及原核表达

11

作者 孙亭亭 马志亮 +2 位作者 冀斌 胡文丽 陈培富 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期47-51,共5页

应用能够选择性克隆同源双链DNA的方法(PCR+1)从刀豆蛋白A诱导的红色原鸡外周血淋巴细胞中扩增γ干扰素(IFN-γ)编码区基因,双酶切后连接至克隆载体pUC18。以阳性质粒为模板扩增IFN-γ成熟肽基因,连接至原核表达载体pProEXTMHTb,筛选出... 应用能够选择性克隆同源双链DNA的方法(PCR+1)从刀豆蛋白A诱导的红色原鸡外周血淋巴细胞中扩增γ干扰素(IFN-γ)编码区基因,双酶切后连接至克隆载体pUC18。以阳性质粒为模板扩增IFN-γ成熟肽基因,连接至原核表达载体pProEXTMHTb,筛选出阳性重组质粒HTb-IFN-γ;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,采用PCR+1方法扩增得到560bp IFN-γ编码区基因,成功连接至克隆载体并以此为模板扩增出473bp成熟肽基因,构建的重组表达质粒HTb-IFN-γ在BL21(DE3)中经IPTG诱导表达出分子质量约为21ku的IFN-γ。Western blot分析显示,表达的IFN-γ能够与抗IFN-γ多克隆抗体特异性反应,具有良好的免疫活性。 展开更多

关键词 红色原鸡 IFN-Γ 不对称pcr 原核表达

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sikFBA4基因启动子的克隆及低温表达模式分析

12

作者 张尧 李忠晴 +1 位作者 王爱英 祝建波 《草业学报》 CSCD 北大核心 2018年第12期199-207,共9页

天山雪莲生长于常年积雪覆盖高海拔处的高山区域,具有很强的极端低温生境适应能力,属于研究植物低温适应的良好模式植物。前期的研究表明,sikFBA4基因可以显著提高番茄的抗寒能力。为进一步研究sikFBA4基因的耐寒响应模式,以天山雪莲为... 天山雪莲生长于常年积雪覆盖高海拔处的高山区域,具有很强的极端低温生境适应能力,属于研究植物低温适应的良好模式植物。前期的研究表明,sikFBA4基因可以显著提高番茄的抗寒能力。为进一步研究sikFBA4基因的耐寒响应模式,以天山雪莲为材料,采用实时荧光定量PCR分析sikFBA4在低温胁迫下的表达模式;利用高效热不对称PCR法(Hi-Tail PCR)克隆sikFBA4启动子序列并进行生物信息学分析。为分析PsikFBA4序列克隆的完整性及转录表达特性,将PsikFBA4与GUS基因融合在烟草中进行瞬时表达。结果表明,sikFBA4在低温胁迫条件下的表达发生瞬时显著上调,并在1h达到峰值,而后表达下调。通过启动子克隆分析,在PsikFBA4序列-1648bp位置处具有冷响应元件LTRE;进一步的GUS染色和酶活力测定结果表明,低温能够显著提高GUS基因的表达活性,说明sikFBA4属于低温诱导型基因。SikFBA4基因启动子的克隆、序列分析以及表达分析,为进一步探究雪莲果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(sikFBAs)基因的表达与调控机制奠定了基础。 展开更多

关键词 天山雪莲 sikFBA4 高效热不对称pcr 启动子 GUS

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添加餐厨废油脂培养酵母进行γ-癸内酯生物转化 被引量：1

13

作者 王荣霞 朱廷恒 汪琨 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第20期106-111,共6页

为了降低工业化生产γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)的成本,利用餐厨废弃油脂代替部分培养基成分培养解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),当添加餐厨废弃油脂6 g/L,葡萄糖由20 g/L降为12.5 g/L,酵母提取物由10 g/L降为5 g/L时,培养12 h... 为了降低工业化生产γ-癸内酯(γ-decalactone,GDL)的成本,利用餐厨废弃油脂代替部分培养基成分培养解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),当添加餐厨废弃油脂6 g/L,葡萄糖由20 g/L降为12.5 g/L,酵母提取物由10 g/L降为5 g/L时,培养12 h后获得与完全培养基相当的生物量。在Y.lipolytica中过表达酰基辅酶A氧化酶基因pox2获得工程菌,将蓖麻油酸转化为GDL产量达1.5 g/L,是出发菌株的2.2倍。利用分解油脂活性高的Y.lipolytica菌株(解脂假丝酵母Candida lipolytica CICC31223)与工程菌混菌降解餐厨废弃油脂并转化蓖麻油生产GDL,最佳条件为:当C.lipolytica与Y.lipolytica工程菌的接种比例为1∶10(体积比)、接种方式为先接种C.lipolytica,28℃,振荡培养(200 r/min)12 h后再接种Y.lipolytica,混菌发酵培养基中GDL产量达0.15 g/L,显著高于工程菌单菌发酵产量0.08 g/L。结果表明,餐厨废弃油脂是廉价的碳源,通过不同菌株的混菌发酵转化生产GDL的方法具有很大的工业化应用前景。 展开更多

关键词 餐厨废弃油脂 解脂耶氏酵母 解脂假丝酵母 Γ-癸内酯 交错式热不对称pcr

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