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一步法微滴数字PCR检测生菜中GII型诺如病毒 被引量：12
1
作者 陈嘉茵 方苓 +4 位作者 吴诗微 唐书泽 张志强 李晖 吴希阳 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期332-337,共6页
目的:采用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术和QX200 Droplet Digital PCR System,建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测生菜中GII型诺如病毒(norovirus geneg... 目的:采用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术和QX200 Droplet Digital PCR System,建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测生菜中GII型诺如病毒(norovirus genegroup II,NoV GII)的方法。方法:优化RT-ddPCR检测NoV GII的反应体系;通过10倍梯度稀释的NoV GII线性阳性质粒确定RT-ddPCR的检测范围;利用其他常见的肠道病毒核酸(非GII型诺如病毒)作为反应模板,与NoV GII核酸同时进行RT-ddPCR,判定反应体系的特异性,并通过不同时间多次检测样品的方式判断该检测方法的稳定性。采用ISO/TS 15216-1:2013食品中诺如病毒RNA提取方法,对人工染毒不同水平(高、中、低)的NoVGII生菜样品进行检测,同时研究去除抑制物前后对RT-ddPCR检测的影响,并与逆转录定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)进行检测回收率的对比,探究RT-ddPCR在食品中NoV GII快速与定量检测上的发展潜力与应用前景。结果:RT-ddPCR的最高检测限为8.47×104 copies/μL,最低检测限为2.12 copies/μL,RT-ddPCR扩增效率为95.44%,标准曲线相关系数为0.997 3。在不同浓度人工染毒生菜样品中,抑制物的存在对ddPCR回收率检测结果没有显著性差异。在高、中染毒浓度下,抑制物对RT-qPCR与RT-ddPCR回收率检测结果影响不显著。低浓度下,未去除抑制物的RT-qPCR法平均回收率仅1.43%,与去除抑制物后的RT-qPCR检测结果(平均回收率为9.71%)有显著差异,且与RT-ddPCR的检测结果(未去除抑制物的RT-ddPCR平均回收率为11.80%,去除抑制物后平均回收率为12.53%)存在显著性差异。结论:生菜抑制物对RT-ddPCR的检测影响不显著,利用RT-ddPCR可有效测出低浓度的受污染样品,避免用现有的RT-qPCR方法因抑制物带来的"假阴性"检测结果。本实验建立的RT-ddPCR方法能高效、灵敏地检测出受污染食品中NoV GII的低病毒含量,在食源性病毒检测中具有可观的发展潜力和应用前景。 展开更多
关键词 逆转录微滴数字聚合酶链式反应 一步法 GII型诺如病毒 生菜 回收率
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A群轮状病毒一步法RT-ddPCR方法的建立 被引量：3
2
作者 徐蕾蕊 马丹 +8 位作者 魏咏新 李丹 魏海燕 刘莉 张西萌 汪琦 付溥博 赵晓娟 曾静 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2020年第12期292-297,共6页
目的:建立A群轮状病毒(rotavirus,RV)一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法。方法:筛选特异性引物探针,建立并优化一步法RT-ddPCR方法,确定特异性;制... 目的:建立A群轮状病毒(rotavirus,RV)一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法。方法:筛选特异性引物探针,建立并优化一步法RT-ddPCR方法,确定特异性;制备含A群RV目的片段的RNA标准物质,确定建立方法的检测限、准确度、重复性和复现性。A群RV阳性粪便样品梯度稀释后制作染毒液,制备人工染毒样品,分离病毒与食品基质,浓缩得到病毒悬液,提取RNA后,比较不同食品基质中一步法RT-ddPCR检测结果。结果:建立的一步法RT-ddPCR方法定量限为58000.00~5.80拷贝/μL,具有良好的特异性、准确性、灵敏度、重复性和复现性。各染毒水平下A群RV检出量和回收率在不同食品基质中存在显著性差异(P<0.05)。结论:研究建立的一步法RT-ddPCR方法可准确定量A群RV RNA,食品基质可影响一步法RT-ddPCR检测结果,通过病毒回收率可计算食品中A群RV的实际载量。 展开更多
关键词 A群轮状病毒 一步法反转录微滴式数字聚合酶链式反应 定量检测 食品基质
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基于RT-dd PCR技术的食品中诺如病毒定量检测 被引量：5
3
作者 徐蕾蕊 李丹 +6 位作者 汪琦 马丹 魏咏新 魏海燕 赵晓娟 张西萌 曾静 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第20期313-320,共8页
目的:构建基于逆转录微滴式聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术的食品中诺如病毒(norovirus,NoV)定量检测方法。方法:筛选引物探针,建立并优化GI、GII型NoV和MS2噬菌体一步... 目的:构建基于逆转录微滴式聚合酶链式反应(reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术的食品中诺如病毒(norovirus,NoV)定量检测方法。方法:筛选引物探针,建立并优化GI、GII型NoV和MS2噬菌体一步法RT-ddPCR检测体系,确定特异性。利用NoV RNA标准物质和MS2噬菌体RNA确认RT-ddPCR检测体系的定量限、准确度和重复性。制备人工阳性样品,分析MS2噬菌体对定量结果的影响。结果:3个RT-ddPCR检测体系具有良好的特异性、准确度和重复性,NoV RT-ddPCR检测体系的定量限包含10~4~10~0拷贝/μL 5个数量级,MS2噬菌体RT-ddPCR检测体系定量限与NoV相当,添加与不添加MS2噬菌体的人工阳性样品的定量结果无显著差异(P≥0.05)。结论:NoV RT-ddPCR检测体系可准确定量NoV RNA,MS2噬菌体不影响定量结果,可作为过程控制的模式病毒被添加到食品中,指示回收率,计算食品中NoV实际载量。 展开更多
关键词 逆转录微滴式数字聚合酶链式反应 诺如病毒 MS2噬菌体 回收率
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