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Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4兔源单克隆抗体的制备和鉴定
1
作者
孔维光
袁新婕
+2 位作者
丁广义
张环宇
徐镇
《渔业研究》
2025年第5期609-619,共11页
【目的】Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)严重危害中国草鱼(Ctenoparyngodonidel-lus)养殖业的健康发展。本研究基于单个B细胞抗体制备技术平台,结合哺乳动物表达系统,旨在制备靶向GCRV-ⅡVP4蛋白的基因工程抗体。【方法】通过构建GCRV-Ⅱ...
【目的】Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)严重危害中国草鱼(Ctenoparyngodonidel-lus)养殖业的健康发展。本研究基于单个B细胞抗体制备技术平台,结合哺乳动物表达系统,旨在制备靶向GCRV-ⅡVP4蛋白的基因工程抗体。【方法】通过构建GCRV-ⅡVP4基因表达载体,在真核表达系统中制备重组VP4蛋白;将纯化后的重组蛋白作为免疫原多次免疫新西兰白兔,分离出脾脏单个抗原特异性记忆B细胞;随后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增抗体可变区、恒定区基因片段,构建重组表达载体并转染HEK293F细胞进行单克隆抗体表达。最终通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光分析(IF)评估抗体的抗原结合特性。【结果】通过对分离培养的单个B细胞上清液进行筛选,利用ELISA筛选出对VP4蛋白具有较好结合能力的三种B细胞克隆(1D5、1F9、1H1),并结合IF实验验证了其能结合病毒感染组织中的VP4抗原。进一步通过抗体重组表达获得了三株抗VP4重组单克隆抗体(1D5、1F9、1H1),其ELISA效价均达1∶128000。Westernblot分析结果显示,1D5、1F9和1H1单克隆抗体能特异性识别GCRV-YX246感染的脑细胞中65.4kDa的蛋白质条带,该分子量大小与病毒VP4蛋白理论分子量一致。IF实验结果也进一步证实1D5、1F9和1H1可特异性识别GCRV-YX246毒株感染的草鱼头肾组织切片中的病毒抗原。【结论】本研究成功制备并筛选出抗GCRV-ⅡVP4重组单克隆抗体,为GCRV-Ⅱ病毒快速诊断试剂盒的研发和VP4蛋白功能研究奠定基础。
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关键词
ⅱ型草鱼呼肠孤病毒
VP4蛋白
单个B细胞技术
单克隆抗体制备
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职称材料
微载体规模化培养草鱼鳔细胞以增殖Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的工艺研究
被引量：
2
2
作者
杨玉茹
王英英
+3 位作者
王庆
周文礼
尹纪元
石存斌
《海洋渔业》
CSCD
北大核心
2022年第5期577-588,共12页
为优化草鱼(Ctenopharyngodon idella)鳔细胞(CiSB)细胞悬浮培养工艺,以提高基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)含量,利用Cytodex 1微载体悬浮培养系统规模化培养CiSB和Ⅱ型GCRV,对CiSB细胞初始接种密度、搅拌转速和微...
为优化草鱼(Ctenopharyngodon idella)鳔细胞(CiSB)细胞悬浮培养工艺,以提高基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)含量,利用Cytodex 1微载体悬浮培养系统规模化培养CiSB和Ⅱ型GCRV,对CiSB细胞初始接种密度、搅拌转速和微载体浓度等工艺参数进行摸索和优化。结果显示,在CiSB细胞贴壁期,以转速30 r·min^(-1)、每静置30 min搅拌2 min的间歇搅拌方式培养最佳,4 h后细胞贴附率可达96%以上;在微载体密度2 g·L^(-1)、细胞初始接种密度2×10^(5)个·mL^(-1)、搅拌速度30 r·min^(-1)的条件下,初始培养血清浓度设定为10%,培养3 d后更换50%的培养基并使血清浓度达到5%,可获得最佳的细胞生长效能。CiSB经消化转移放大至1 L,微载体上细胞贴附均匀、生长良好。接种Ⅱ型GCRV至规模化培养的CiSB细胞,拷贝数最高达6.2×10^(5)拷贝数·μL^(-1)。研究结果可为草鱼出血病疫苗的规模化生产工艺研究提供依据。
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关键词
草鱼
鳔细胞(CiSB)
ⅱ型草鱼呼肠孤病毒
微载体培养
工艺优化
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职称材料
全预混冻干PCR试剂检测草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的研究
被引量：
7
3
作者
侯月娥
伍建敏
+4 位作者
王凤求
赵玉林
张杰
王贵平
李中圣
《水产科学》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第1期80-85,共6页
草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型是导致草鱼出血病的主要病原体之一,目前在我国广泛流行。本研究根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型基因序列,设计了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法TaqMan荧...
草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型是导致草鱼出血病的主要病原体之一,目前在我国广泛流行。本研究根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型基因序列,设计了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。试验对反转录和PCR反应体系进行摸索,通过优化的冻干工艺制备出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型全预混RT-PCR试剂,在荧光定量PCR中,冻干试剂的检测灵敏度可达10个模板,是普通PCR的100倍。批次间变异系数小于4%。特异性试验结果表明,该方法可特异性地检出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型,而对鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死症病毒无检测信号。该冻干试剂4℃保存12个月,室温25℃保存3个月,37℃保存15d,敏感性仍为10个,与第1d相同;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42min内完成核酸诊断。本试验基于荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的全预混草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型RT-PCR试剂具有耐保存便于运输、准确性高、仪器拓展性好的特点,对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型快速诊断有重要意义。
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关键词
草鱼
呼肠
孤
病毒
ⅱ
型
冻干试剂
TaqMan荧光定量RT-PCR
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职称材料
题名
Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4兔源单克隆抗体的制备和鉴定
1
作者
孔维光
袁新婕
丁广义
张环宇
徐镇
机构
中国科学院水生生物研究所
出处
《渔业研究》
2025年第5期609-619,共11页
基金
国家自然科学基金(32225050、U24A20461、32303053)。
文摘
【目的】Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)严重危害中国草鱼(Ctenoparyngodonidel-lus)养殖业的健康发展。本研究基于单个B细胞抗体制备技术平台,结合哺乳动物表达系统,旨在制备靶向GCRV-ⅡVP4蛋白的基因工程抗体。【方法】通过构建GCRV-ⅡVP4基因表达载体,在真核表达系统中制备重组VP4蛋白;将纯化后的重组蛋白作为免疫原多次免疫新西兰白兔,分离出脾脏单个抗原特异性记忆B细胞;随后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增抗体可变区、恒定区基因片段,构建重组表达载体并转染HEK293F细胞进行单克隆抗体表达。最终通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫荧光分析(IF)评估抗体的抗原结合特性。【结果】通过对分离培养的单个B细胞上清液进行筛选,利用ELISA筛选出对VP4蛋白具有较好结合能力的三种B细胞克隆(1D5、1F9、1H1),并结合IF实验验证了其能结合病毒感染组织中的VP4抗原。进一步通过抗体重组表达获得了三株抗VP4重组单克隆抗体(1D5、1F9、1H1),其ELISA效价均达1∶128000。Westernblot分析结果显示,1D5、1F9和1H1单克隆抗体能特异性识别GCRV-YX246感染的脑细胞中65.4kDa的蛋白质条带,该分子量大小与病毒VP4蛋白理论分子量一致。IF实验结果也进一步证实1D5、1F9和1H1可特异性识别GCRV-YX246毒株感染的草鱼头肾组织切片中的病毒抗原。【结论】本研究成功制备并筛选出抗GCRV-ⅡVP4重组单克隆抗体,为GCRV-Ⅱ病毒快速诊断试剂盒的研发和VP4蛋白功能研究奠定基础。
关键词
ⅱ型草鱼呼肠孤病毒
VP4蛋白
单个B细胞技术
单克隆抗体制备
Keywords
grass carp reovirus genotype
ⅱ
(GCRV-
ⅱ
)
VP4 protein
single B cell technology
monoclonal antibodies preparation
分类号
S941 [农业科学—水产养殖]
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职称材料
题名
微载体规模化培养草鱼鳔细胞以增殖Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的工艺研究
被引量：
2
2
作者
杨玉茹
王英英
王庆
周文礼
尹纪元
石存斌
机构
天津农学院水产学院
中国水产科学研究院珠江水产研究所
出处
《海洋渔业》
CSCD
北大核心
2022年第5期577-588,共12页
基金
国家重点研发计划(2019YFD0900103)
中国水产科学研究院中央公益性科研院所基本科研业务费专项(2020XT0403)
+2 种基金
广东省基础与应用基础研究基金(2020A1515010327)
国家大宗淡水鱼产业技术体系(CARS-45)
广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金(2022KJ150,2022KJ119)。
文摘
为优化草鱼(Ctenopharyngodon idella)鳔细胞(CiSB)细胞悬浮培养工艺,以提高基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)含量,利用Cytodex 1微载体悬浮培养系统规模化培养CiSB和Ⅱ型GCRV,对CiSB细胞初始接种密度、搅拌转速和微载体浓度等工艺参数进行摸索和优化。结果显示,在CiSB细胞贴壁期,以转速30 r·min^(-1)、每静置30 min搅拌2 min的间歇搅拌方式培养最佳,4 h后细胞贴附率可达96%以上;在微载体密度2 g·L^(-1)、细胞初始接种密度2×10^(5)个·mL^(-1)、搅拌速度30 r·min^(-1)的条件下,初始培养血清浓度设定为10%,培养3 d后更换50%的培养基并使血清浓度达到5%,可获得最佳的细胞生长效能。CiSB经消化转移放大至1 L,微载体上细胞贴附均匀、生长良好。接种Ⅱ型GCRV至规模化培养的CiSB细胞,拷贝数最高达6.2×10^(5)拷贝数·μL^(-1)。研究结果可为草鱼出血病疫苗的规模化生产工艺研究提供依据。
关键词
草鱼
鳔细胞(CiSB)
ⅱ型草鱼呼肠孤病毒
微载体培养
工艺优化
Keywords
grass carp swim bladder cells(CiSB)
genotype
ⅱ
grass carp reovirus
microcarrier culture
technology optimization
分类号
S942.5 [农业科学—水产养殖]
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职称材料
题名
全预混冻干PCR试剂检测草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的研究
被引量：
7
3
作者
侯月娥
伍建敏
王凤求
赵玉林
张杰
王贵平
李中圣
机构
广东海大集团股份有限公司
出处
《水产科学》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第1期80-85,共6页
基金
广州市科技创新委员会项目(201508020072)
文摘
草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型是导致草鱼出血病的主要病原体之一,目前在我国广泛流行。本研究根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型基因序列,设计了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型一步法TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。试验对反转录和PCR反应体系进行摸索,通过优化的冻干工艺制备出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型全预混RT-PCR试剂,在荧光定量PCR中,冻干试剂的检测灵敏度可达10个模板,是普通PCR的100倍。批次间变异系数小于4%。特异性试验结果表明,该方法可特异性地检出草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型,而对鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死症病毒无检测信号。该冻干试剂4℃保存12个月,室温25℃保存3个月,37℃保存15d,敏感性仍为10个,与第1d相同;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42min内完成核酸诊断。本试验基于荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的全预混草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型RT-PCR试剂具有耐保存便于运输、准确性高、仪器拓展性好的特点,对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型快速诊断有重要意义。
关键词
草鱼
呼肠
孤
病毒
ⅱ
型
冻干试剂
TaqMan荧光定量RT-PCR
Keywords
Grass carp reovirus
ⅱ
lyophilized reagent
TaqMan real-time quantitative RT-PCR
分类号
S948 [农业科学—水产养殖]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4兔源单克隆抗体的制备和鉴定
孔维光
袁新婕
丁广义
张环宇
徐镇
《渔业研究》
2025
0
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
微载体规模化培养草鱼鳔细胞以增殖Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的工艺研究
杨玉茹
王英英
王庆
周文礼
尹纪元
石存斌
《海洋渔业》
CSCD
北大核心
2022
2
在线阅读
下载PDF
职称材料
3
全预混冻干PCR试剂检测草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的研究
侯月娥
伍建敏
王凤求
赵玉林
张杰
王贵平
李中圣
《水产科学》
CAS
CSCD
北大核心
2019
7
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职称材料
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