【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采...【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。展开更多
为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,研究根据鸭BATV非结构蛋白(NSs)基因特征,设计引物,经条件优化后建立检测BATV感染的qRT-PCR方法。用建立的qRT-PCR方法对临床72份疑似BATV感染的病...为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,研究根据鸭BATV非结构蛋白(NSs)基因特征,设计引物,经条件优化后建立检测BATV感染的qRT-PCR方法。用建立的qRT-PCR方法对临床72份疑似BATV感染的病料进行检测,并对阳性样品进行病毒分离,评价两种方法的符合率。结果表明,当病毒NS基因含量为3.59×10~2~3.59×10~7拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.9994,扩增效率为98%。最低检测限为3.59×10~2拷贝/μL;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(81.60±0.16)℃,对鸭源常见病毒(如鸭甲肝病毒、禽坦布苏病毒、禽Ⅰ型副黏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新型鸭呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒)检测均为阴性,组内变异系数和组间变异系数分别为0.49%~1.99%和0.58%~2.18%。临床送检的72份病料SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的阳性率为4.17%(3/72),并分离到2株鸭源BATV,2种方法的阳性符合率为66.67%(2/3)。建立的基于SYBRⅠ检测BATV的qRT-PCR方法、特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于BATV的分子流行病学研究。展开更多
为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显...为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。展开更多
本研究针对病毒基因组5'端非编码区的保守区域设计引物,建立了用于检测鸡传染性腺胃炎相关的圆圈病毒3型(Gyv3)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。该方法具有较好的特异性,敏感性和重复性,对于鸡Gyv3以外的其他常见鸡病毒性病原的DNA...本研究针对病毒基因组5'端非编码区的保守区域设计引物,建立了用于检测鸡传染性腺胃炎相关的圆圈病毒3型(Gyv3)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。该方法具有较好的特异性,敏感性和重复性,对于鸡Gyv3以外的其他常见鸡病毒性病原的DNA或cDNA均无特异性扩增,灵敏度能达到30.76 copies/μL,组内和组间变异系数均不超过2%。对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量PCR方法对鸡Gyv3检出率为12.28%。展开更多
为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方...为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10^(1)~6.26×10^(8)copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。展开更多
文摘【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。
文摘为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,研究根据鸭BATV非结构蛋白(NSs)基因特征,设计引物,经条件优化后建立检测BATV感染的qRT-PCR方法。用建立的qRT-PCR方法对临床72份疑似BATV感染的病料进行检测,并对阳性样品进行病毒分离,评价两种方法的符合率。结果表明,当病毒NS基因含量为3.59×10~2~3.59×10~7拷贝/μL时有良好的线性扩增,其扩增相关系数为0.9994,扩增效率为98%。最低检测限为3.59×10~2拷贝/μL;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(81.60±0.16)℃,对鸭源常见病毒(如鸭甲肝病毒、禽坦布苏病毒、禽Ⅰ型副黏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新型鸭呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒)检测均为阴性,组内变异系数和组间变异系数分别为0.49%~1.99%和0.58%~2.18%。临床送检的72份病料SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的阳性率为4.17%(3/72),并分离到2株鸭源BATV,2种方法的阳性符合率为66.67%(2/3)。建立的基于SYBRⅠ检测BATV的qRT-PCR方法、特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于BATV的分子流行病学研究。
文摘为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。
文摘本研究针对病毒基因组5'端非编码区的保守区域设计引物,建立了用于检测鸡传染性腺胃炎相关的圆圈病毒3型(Gyv3)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。该方法具有较好的特异性,敏感性和重复性,对于鸡Gyv3以外的其他常见鸡病毒性病原的DNA或cDNA均无特异性扩增,灵敏度能达到30.76 copies/μL,组内和组间变异系数均不超过2%。对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量PCR方法对鸡Gyv3检出率为12.28%。
文摘为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10^(1)~6.26×10^(8)copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。
