应用“酶切连接”克隆法构建TALEs 被引量：1

1

作者 梁龙 杨华 +3 位作者 杨永林 石国庆 刘守仁 皮文辉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2013年第3期306-312,共7页

TALEs是在植物病原菌黄单胞杆菌(Xanthomonas)上发现的一类天然的DNA结合蛋白,其重复域已经成为模块化构建单元,用于人工DNA结合蛋白的构建。人工TALEs能够用于多种基因工程操作,包括转录调节和基因组编辑。为了在常规分子生物学实验室... TALEs是在植物病原菌黄单胞杆菌(Xanthomonas)上发现的一类天然的DNA结合蛋白,其重复域已经成为模块化构建单元,用于人工DNA结合蛋白的构建。人工TALEs能够用于多种基因工程操作,包括转录调节和基因组编辑。为了在常规分子生物学实验室稳定、经济地构建TALE-TFs和TALENs,本文采用TALE Toolbox试剂盒,运用PCR扩增和"酶切-连接"克隆法构建人工TALEs。结果表明,该构建策略是一种快速高效构建TALEs的方法,能够在1周内完成TALEs构建。 展开更多

关键词 转录激活因子样效应子 “酶切-连接”克隆法

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质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法检测沙眼衣原体 被引量：7

2

作者 伍金林 韦红 +1 位作者 吴仕孝 刘官信 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期148-150,共3页

目的:建立高度灵敏特异的质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法(Gap-LCR-ELISA)检测沙眼衣原体(Chlamy-diatrachomatisCT)。方法:根据CT共有隐蔽性质粒设计并标记4条寡核苷酸探针,对6型CT标准株和鹦鹉热衣原体及其他常见泌尿生殖道病... 目的:建立高度灵敏特异的质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法(Gap-LCR-ELISA)检测沙眼衣原体(Chlamy-diatrachomatisCT)。方法:根据CT共有隐蔽性质粒设计并标记4条寡核苷酸探针,对6型CT标准株和鹦鹉热衣原体及其他常见泌尿生殖道病原菌行Gap-LCR-ELISA。结果:质粒Gap-LCR-ELISA可检测出6型CT,并与其他病原体无交叉反应,其最低检测限为2.5个原体(elementarybodiesEB)比PCR敏感10倍。结论:质粒Gap-LCR-ELISA对检测CT感染具有极高的灵敏度和特异度,适宜于我国进行大规模CT流行病学调查。 展开更多

关键词 衣原体 沙眼 质粒 缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法

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缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法检测孕妇沙眼衣原体感染 被引量：2

3

作者 伍金林 韦红 +2 位作者 吴仕孝 钟晓云 余加林 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期10-13,共4页

目的:用缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附(Gap-LCR-ELISA)法检测重庆地区孕妇沙眼衣原体感染,以了解围生期沙眼衣原体(CT)的感染现状。方法:以512名孕妇首段尿(FVU)及配对宫颈刮片为研究对象,按照扩大金标准,采用质粒探针和外膜蛋白探针G... 目的:用缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附(Gap-LCR-ELISA)法检测重庆地区孕妇沙眼衣原体感染,以了解围生期沙眼衣原体(CT)的感染现状。方法:以512名孕妇首段尿(FVU)及配对宫颈刮片为研究对象,按照扩大金标准,采用质粒探针和外膜蛋白探针Gap-LCR-ELISA法用于不同类型临床标本检测CT感染。结果:①孕妇的CT感染呈很强的隐匿性,由扩大金标准所确证的CT真阳性共42例,所检重庆地区孕妇的CT感染率为8.2%(42/512),其中88.1%(37/42)可同时从尿道和生殖道检出CT,而另9.5%(4/42)和2.4%(1/42)仅能单独分别从生殖道或尿道检出。②Gap-LCR-ELISA用质粒与外膜蛋白作为探针检测FVU中CT的敏感性分别为90.48%和71.43%(P<0.05),质粒Gap-LCR-ELISA用于宫颈刮片和FVU两种标本的敏感性分别为97.62%和90.48%(P>0.05),特异性均为100%。结论:质粒Gap-LCR-ELISA法用于孕妇FVU以检测围生期无症状CT感染患者,是一种非侵袭性的、高度敏感特异的、适合于发展中国家和地区进行大规模流行病学调查的方法。 展开更多

关键词 沙眼衣原体 尿 缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法 孕妇

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质粒缺口-连接酶链反应-ELISA法检测重庆地区围生期孕妇沙眼衣原体感染及基因分型 被引量：2

4

作者 伍金林 韦红 +1 位作者 吴仕孝 钟晓云 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期280-282,共3页

目的:用质粒缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)-ELISA法研究重庆地区围生期孕妇沙眼衣原体(CT)感染的现状及流行的主要基因型别,为其疫苗的研制提供分子流行病学依据。方法:以512例孕妇的首段尿(FVU)及其配对新生儿的鼻咽拭子为标本,用质粒Gap... 目的:用质粒缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)-ELISA法研究重庆地区围生期孕妇沙眼衣原体(CT)感染的现状及流行的主要基因型别,为其疫苗的研制提供分子流行病学依据。方法:以512例孕妇的首段尿(FVU)及其配对新生儿的鼻咽拭子为标本,用质粒Gap-LCR-ELISA法检测CT感染者,对阳性母、婴配对标本DNA行omp1-VS4-PCR扩增,产物行双链DNA直接测序并作基因分型。结果:所检重庆地区孕妇CT感染率为7.42%,母婴垂直传播率为15.79%,以阴道分娩为主要传播途径。6对阳性母婴配对标本的CT基因序列一致,其中5对为E型,1对为H型,再次证实了CT的垂直传播途径。结论:质粒Gap-LCR-ELISA法可用于围生期无症状CT感染孕妇的大规模流行病学调查。重庆地区围生期CT流行型别仍以E型为主。 展开更多

关键词 沙眼衣原体 质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法 感染 围生期 基因分型

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短小芽孢杆菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的分泌表达 被引量：2

5

作者 郭成栓 欧阳蒲月 +1 位作者 崔堂兵 郭勇 《化学与生物工程》 CAS 2010年第12期53-55,68,共4页

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌H12中克隆了编码β-1,4-葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及其酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3... 从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌H12中克隆了编码β-1,4-葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及其酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行表达。结果表明,该基因大小为1980 bp,共编码659个氨基酸;对β-1,4-葡聚糖内切酶结构域分析表明,该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;平板实验结果表明,β-1,4-葡聚糖内切酶基因在重组大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;SDS-PAGE电泳图谱表明该酶的分子大小约为73 kDa。 展开更多

关键词 β-1 4-葡聚糖内切酶 大肠杆菌 短小芽孢杆菌 克隆 表达

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一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

6

作者 蒋海芹 毕云枫 +3 位作者 华欣春 陈丽丽 徐雪霏 沈明浩 《纺织学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第8期82-86,共5页

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因... 以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。 展开更多

关键词 纤维素 β-1 4-葡聚糖内切酶 嗜热梭菌 克隆 原核表达

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甜高粱4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)的克隆与鉴定及时空表达分析 被引量：12

7

作者 周 王玉锋 +4 位作者 娄来清 周华 陈素丽 蔡庆生 滕胜 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期9-19,共11页

通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家... 通过对木质素合成途径中关键的限速酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,EC6.2.1.12)基因克隆、鉴定与时空表达分析来研究甜高粱4CL基因家族的特性,为今后利用基因工程手段改造甜高粱木质素提供一定的理论依据。搜索NCBI数据库得到高粱4CL基因家族序列,以甜高粱品种‘大力士’的cDNA为模板克隆得到甜高粱4CL家族中各蛋白编码序列(CDS),CDS连入表达载体pET51B,转入大肠杆菌表达菌株(BL21)进行诱导表达,镍柱纯化后进行酶活性分析。实时定量荧光PCR(qPCR)检测甜高粱4CL基因家族各成员在不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明:通过在NCBI数据库中对植物4CL蛋白序列分析,在高粱基因组中,鉴定出7个4CL类似(4CL-like)基因。序列对位排列分析显示:甜高粱7个4CL-like基因在高粱属中非常保守;其氨基酸序列与水稻相对应的Os4CL有90%左右的相似度;它们可分为4CL ClassⅠ和4CL ClassⅡ两类,其中Sb07G007810、Sb04G005210、Sb10G026130、Sb07G022040、Sb03G000610和Sb06G016630属于4CL ClassⅠ,Sb04G031010属于4CL ClassⅡ。酶活性分析表明甜高粱7个4CL蛋白都具有4-香豆酸辅酶A连接酶活力。通过对甜高粱7个4CL基因时空表达分析发现,参与木质素合成的4CL ClassⅠ类基因在组织生长快速期的表达量非常高,而参与类黄酮合成的4CL ClassⅡ类基因在植物受到太阳直接照射的部位表达量显著地增加。在根和茎中,Sb04G005210基因的表达量最高;在叶中,Sb07G007810基因的表达量最高。上述甜高粱7个基因属于真正的4CL基因。 展开更多

关键词 甜高粱 4-香豆酸辅酶A连接酶 木质素 时空表达 类黄酮 酶活性 基因克隆

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黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析 被引量：2

8

作者 蔡可 王太康 +5 位作者 王君 董自星 田康明 金鹏 刘晓光 王正祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期29-35,共7页

利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC 3. 2. 1. 89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因agh A在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了... 利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC 3. 2. 1. 89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因agh A在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌GS115(p PIC-aghA)。摇瓶培养条件下,重组酶Agh A的酶活为130 U/m L,高于大多数已报道的半乳聚糖酶的酶活。酶学性质的研究表明,该酶的最适反应pH值和温度分别为4. 5和45℃,且在pH 4. 0～6. 0或30～50℃具有较好稳定性。大部分金属离子和EDTA对重组酶Agh A的酶活没有显著影响; Fe3+对其活性有强烈的抑制作用;而Hg2+则可使Agh A几乎完全失活。该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400 mg/(m L·min)和0. 08 mg/m L。此外,重组酶Agh A还可以水解土豆浆,产生半乳二糖、半乳三糖和少量半乳四糖等低聚半乳糖。 展开更多

关键词 内切β-1 4-半乳聚糖酶 低聚半乳糖 黑曲霉 分子克隆 酶学性质

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GoldenBraid酶切连接反应体系的优化

9

作者 徐美慧 张耀杰 +1 位作者 唐克轩 苗志奇 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期266-274,共9页

旨在获得更为高效稳定的GoldenBraid(GB)酶切连接组装反应体系。通过优化GB反应中酶切时间、缓冲体系、限制性内切酶和底物配伍来提高有效克隆的效率,确定最佳反应体系。结果显示,4 min酶切时间,1μL FastDigest Buffer(10×)缓冲体... 旨在获得更为高效稳定的GoldenBraid(GB)酶切连接组装反应体系。通过优化GB反应中酶切时间、缓冲体系、限制性内切酶和底物配伍来提高有效克隆的效率,确定最佳反应体系。结果显示,4 min酶切时间,1μL FastDigest Buffer(10×)缓冲体系,1 mmol/L ATP,0.5μL FastDigest Esp3I或FastDigest Eco31I,元件供体载体与受体载体的摩尔比3∶1时,有效克隆比例接近99%,是优化前(BsmBI 8%、BsaI 23%)的4倍以上,此时酶切连接效率接近100%。与原始方案相比,通过体系的优化,可以在更少内切酶用量(原方案为1μL)的情况下,显著提高有效克隆比例,表明本方法能提高GB系统的酶切连接效率和实用性。 展开更多

关键词 GoldenBraid 优化 有效克隆 酶切连接效率

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鸡白细胞介素-2基因的克隆与酵母表达质粒的构建 被引量：4

10

作者 张辉华 毕英佐 +2 位作者 曹永长 马静云 周庆丰 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期102-105,共4页

从经ConA活化的4周龄岭南黄鸡脾脏淋巴细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT PCR)扩增出鸡白细胞介素 2(IL 2)cDNA片断.PCR产物克隆至pGEM TEasy载体,重组质粒命名为IL 2 T,经菌落PCR与限制酶切鉴定,然后测序,结果表明克隆片断长度为43... 从经ConA活化的4周龄岭南黄鸡脾脏淋巴细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT PCR)扩增出鸡白细胞介素 2(IL 2)cDNA片断.PCR产物克隆至pGEM TEasy载体,重组质粒命名为IL 2 T,经菌落PCR与限制酶切鉴定,然后测序,结果表明克隆片断长度为432bp,与预期大小一致,为鸡IL 2基因的编码区全长.将IL 2 T克隆重组质粒进行双酶切(ClaI与XbaI),回收IL 2片断插入同样酶切的毕赤酵母表达质粒pPICZα C,构建重组IL 2 C表达质粒,为鸡IL 2在毕赤酵母中的表达奠定基础. 展开更多

关键词 IL-2 白细胞介素-2 酵母表达 克隆 表达质粒 重组质粒 基因 毕赤酵母 酶切 菌落PCR

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用质粒Gap-LCR-ELISA法检测孕妇尿中沙眼衣原体 被引量：3

11

作者 伍金林 韦红 +2 位作者 吴仕孝 钟晓云 余加林 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期523-525,共3页

目的:研究孕妇尿液中对质粒缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)-ELISA法检测沙眼衣原体(CT)产生抑制作用的物质及其去除方法,以提高该方法检测无症状孕妇CT感染的灵敏度。方法:对181份孕妇首段尿(FVU)进行全面尿化学分析后,采用CT标准株“Spik... 目的:研究孕妇尿液中对质粒缺口-连接酶链反应(Gap-LCR)-ELISA法检测沙眼衣原体(CT)产生抑制作用的物质及其去除方法,以提高该方法检测无症状孕妇CT感染的灵敏度。方法:对181份孕妇首段尿(FVU)进行全面尿化学分析后,采用CT标准株“Spike”法(铆钉法),对出现Gap—LCR—ELISA抑制的标本用多因素非条件Logistic回归分析与抑制作用相关的成分,在进行一系列去抑制处理后比较各方法的转阳率。结果:孕妇FVU对质粒Gap-LCR-ELISA检测CT的抑制率为6.08％(11/181),其中白细胞和磷酸盐结晶与抑制作用相关;对FVU作-70℃～37℃快速冻融2次的预处理可使90.91％的假阴性转为阳性,并对模板无明显降解作用。结论:孕妇尿液中确有对Gap—LCR—ELISA产生抑制作用的物质存在,可通过改良标本预处理的方法降低其所致的假阴性。 展开更多

关键词 沙眼衣原体 尿 孕妇 质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法 抑制物

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HLA-Ⅱ血清学分型与微量SSP法基因分型的比较分析 被引量：2

12

作者 武大林 凌汉新 +1 位作者 丁红 张怡 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第3期247-249,共3页

目的验证微量序列特异性引物(SSP)技术进行HLA-Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法采用聚合酶链反应结合微量SSP技术(简称微量PCR-SSP法)以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果... 目的验证微量序列特异性引物(SSP)技术进行HLA-Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法采用聚合酶链反应结合微量SSP技术(简称微量PCR-SSP法)以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果(1)微量PCR-SSP法检测的110例样本中,99例检出HLA-DR的396个等位基因、11例检出HLA-DQ的22个等位基因,检出10%的单倍型个体;(2)两种方法对比研究发现单克隆抗体血清学分型检出错误或漏检率较高,其误差在DR和DQ分别为38.81%和50.75%;(3)错误发生和易混淆的抗原为:DR15/16、11/12、13/14、8、12和DQ5/6、8/9。结论微量SSP法可以准确检定血清学易漏检和发生错误的抗原等位基因。 展开更多

关键词 聚合酶链反应 序列特异性引物 人类白细胞抗原-Ⅱ类 等位基因分型 单克隆抗体 SSP法 移植配型 HLA-Ⅱ 基因分型 血清学分型

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饲用纤维素酶活力的测定方法 被引量：1

13

作者 王婷婷 《养殖技术顾问》 2014年第10期233-234,共2页

由于测定纤维素酶系的多种酶的酶活方法之间是相互联系的和复杂,使得确定酶活力测定的标准化方法非常困难。为给不同目的纤维素酶酶活力测定方法的选择提供借鉴,本文对测定纤维素酶酶活的一般方法,包括滤纸法、内切葡聚糖酶酶活法、纤... 由于测定纤维素酶系的多种酶的酶活方法之间是相互联系的和复杂,使得确定酶活力测定的标准化方法非常困难。为给不同目的纤维素酶酶活力测定方法的选择提供借鉴,本文对测定纤维素酶酶活的一般方法,包括滤纸法、内切葡聚糖酶酶活法、纤细二糖酶酶活测定、外切葡聚糖酶酶活测定等方法进行了综述。 展开更多

关键词 纤维素酶 滤纸法 内切葡聚糖酶酶活 纤维二糖酶(β-葡萄糖苷酶)酶活

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抗亲和素鼠单克隆抗体增强亲和素-生物素免疫技术和免疫组织学染色的敏感性

14

作者 W.F.Cassano 张红毅 《单克隆抗体通讯》 CSCD 1989年第2期64-64,共1页

亲和素、生物素已应用于增加传统免疫酶方法的敏感性。但有时发现在检测微量抗原时，敏感性依然不够。为此，作者建立了几株抗卵清和素糖蛋白的鼠单抗，通过选择性扩大ABC复合物，增加底物信号，增强亲和素一生物素免疫测定法的敏感性。

关键词 免疫组织学染色 亲和素-生物素 敏感性 鼠单克隆抗体 免疫技术 免疫测定法 微量抗原 免疫酶 鼠单抗 糖蛋白 复合物 ABC

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食品中残留19-去甲睾酮免疫原的合成与鉴定 被引量：6

15

作者 余德河 胥传来 +3 位作者 彭池方 王武康 郭金花 金征宇 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第5期195-198,共4页

19-去甲睾酮(19-nortestosteroneNT),属于半抗原生物小分子,具有免疫反应性,但不具有免疫原性。本文中19-去甲睾酮经羧甲基羟胺肟化,质谱(MS)检验后,采用混合酸酐法将肟化产物与牛血清蛋白(bovineserumalbuminBSA)偶联,紫外分光光度法... 19-去甲睾酮(19-nortestosteroneNT),属于半抗原生物小分子,具有免疫反应性,但不具有免疫原性。本文中19-去甲睾酮经羧甲基羟胺肟化,质谱(MS)检验后,采用混合酸酐法将肟化产物与牛血清蛋白(bovineserumalbuminBSA)偶联,紫外分光光度法测定其交联率为24。用此合成产物进行动物体免疫,获得了NT的多克隆抗体。经间接酶联免疫测定,其抗血清的稀释度可以达到1:102400,证明诺龙免疫原的合成成功,为诺龙酶联免疫试剂盒的研究奠定基础。 展开更多

关键词 19-去甲睾酮(NT) 混合酸酐法 多克隆抗体 间接酶联免疫 免疫原

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莱克多巴胺单克隆抗体的制备与初步鉴定 被引量：5

16

作者 曲勍 齐孟文 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期393-396,共4页

为了对莱克多巴胺进行酶联免疫法测定,经由混合酸酐法合成莱克多巴胺免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤单克隆化技术最终得到了1株名为3E1-C9-E10的能稳定分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA测定,细胞培养上清的效价... 为了对莱克多巴胺进行酶联免疫法测定,经由混合酸酐法合成莱克多巴胺免疫原,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤单克隆化技术最终得到了1株名为3E1-C9-E10的能稳定分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA测定,细胞培养上清的效价为1×105,腹水的效价达1×107以上,与多巴酚丁胺有24%的交叉反应率,与沙丁胺醇、克伦特罗没有交叉反应率。 展开更多

关键词 莱克多巴胺 β-肾上腺素激动剂 单克隆抗体 BALB/C小鼠 杂交瘤细胞株 酶联免疫法 鉴定 制备 混合酸酐法 ELISA

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人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法 被引量：1

17

作者 韦相才 卢丽 +3 位作者 黄冰 韩俊英 洪迅 陈系古 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2005年第2期119-123,共5页

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连... 目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。 展开更多

关键词 地中海贫血 外源基因 制备方法 转基因小鼠 重组质粒 调控序列 显微注射 PCR扩增 DNA测序 DNA片段 PCR法 分离纯化 基因克隆 LCR 基础 纯合子 杂交法 酶反应 酶切 点杂交 制作 反向 载体 构建

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gutD基因的克隆及植物表达载体的构建

18

作者 王悦 燕丽萍 +2 位作者 夏阳 李阳春 洪春 《山东林业科技》 2007年第6期39-41,共3页

通过RT-PCR的方法从大肠杆菌K12中扩增出了gutD基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD18 T-vector中,序列分析表明克隆的片段长度为780bp,包含了完整的gutD基因的编码序列,除编码区第61位密码子由CTG变为CGT和第72位密码子CTT变为CCT其它序... 通过RT-PCR的方法从大肠杆菌K12中扩增出了gutD基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD18 T-vector中,序列分析表明克隆的片段长度为780bp,包含了完整的gutD基因的编码序列,除编码区第61位密码子由CTG变为CGT和第72位密码子CTT变为CCT其它序列与所报道的修正序列一致。以BamHⅠ和HindIII限制性内切酶从克隆载体上切取gutD基因,将其连接在相应酶切的中间载体KS上,再以KpnI和BamHI酶切重组子获得具粘性末端的目的片段(gutD)与植物表达载体pCAMBIA2300连接,重组质粒通过双酶切和PCR鉴定正确后,采用直接转化法将pCAMBIA2300-gutD质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并用PCR方法进行了鉴定。 展开更多

关键词 6-磷酸山梨醇脱氢酶基因(gutD) 克隆 序列分析 PCR及酶切检测

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茉莉酸甲酯处理对鲜切菠萝品质及抗氧化活性的影响 被引量：28

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作者 季悦 李静 +2 位作者 王雷 金鹏 郑永华 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第1期258-263,共6页

研究茉莉酸甲酯处理对鲜切菠萝贮藏期间品质和抗氧化活性的影响。先将完整的菠萝果实在20℃条件下分别用浓度为0、1、10、100μmol/L的茉莉酸甲酯熏蒸12 h,然后进行鲜切加工并于15℃条件下贮藏48 h。结果表明,茉莉酸甲酯处理可促进鲜切... 研究茉莉酸甲酯处理对鲜切菠萝贮藏期间品质和抗氧化活性的影响。先将完整的菠萝果实在20℃条件下分别用浓度为0、1、10、100μmol/L的茉莉酸甲酯熏蒸12 h,然后进行鲜切加工并于15℃条件下贮藏48 h。结果表明,茉莉酸甲酯处理可促进鲜切菠萝总酚含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力上升,抑制可溶性固形物及可滴定酸含量下降,而对色泽及菌落总数无显著影响(P>0.05)。其中,10μmol/L茉莉酸甲酯处理效果最好,能显著地诱导鲜切菠萝贮藏期间苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羟化酶活力的上升(P<0.05),延缓4-香豆酸辅酶A连接酶活力的下降(P<0.05),从而促进总酚和总黄酮的积累,提高DPPH自由基清除能力。这些结果表明,茉莉酸甲酯处理可保持鲜切菠萝的品质并提高其抗氧化活性。 展开更多

关键词 茉莉酸甲酯 鲜切菠萝 苯丙氨酸解氨酶 肉桂酸-4-羟化酶 4-香豆酸辅酶A连接酶 抗氧化活性

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脾源鸭γ-干扰素基因的RT-PCR扩增、序列分析及表达 被引量：2

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作者 张晓宇 李凤华 +6 位作者 邵钢 宋晓林 陈艳 康丽娟 江庆国 庄国宏 江国托 《中国家禽》 北大核心 2005年第11期14-16,共3页

从丝裂原刺激的鸭脾淋巴细胞中提取基因组 RNA,采用 RT-PCR 扩增鸭干扰素γ基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸭干扰素γ基因序列全长477bp,开放阅读框架内401个核苷酸,共编码132个氨基酸。将鸭γ-IFN 基因定向克隆到原核表达载... 从丝裂原刺激的鸭脾淋巴细胞中提取基因组 RNA,采用 RT-PCR 扩增鸭干扰素γ基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸭干扰素γ基因序列全长477bp,开放阅读框架内401个核苷酸,共编码132个氨基酸。将鸭γ-IFN 基因定向克隆到原核表达载体pBV220中,重组质粒经酶切鉴定后,转化到宿主菌 DH5a 中,温度诱导表达,SDS-PAGE 分析,表达产物与标记抗鸡干扰素抗体出现 Dot-ELISA 阳性反应。 展开更多

关键词 PCR扩增 序列分析 Γ-干扰素基因 RT 鸭 开放阅读框架 PBV220 原核表达载体 脾淋巴细胞 ELISA 干扰素γ 分析结果 基因序列 定向克隆 酶切鉴定 重组质粒 诱导表达 PAGE 阳性反应 鸡干扰素 表达产物 RNA 基因组 丝裂原 核苷酸

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