重叠延伸PCR技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体 被引量：2

1

作者 王华 文一 +4 位作者 于寒松 朴春红 王玉华 刘俊梅 胡耀辉 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第19期145-147,151,共4页

采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒... 采用重叠延伸PCR技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经PCR鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。 展开更多

关键词 β-环糊精葡糖糖基转移酶 重叠延伸PCR 定点突变 原核表达载体 构建

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β-环糊精葡萄糖基转移酶突变基因的表达及突变酶酶学性质分析

2

作者 王华 李华 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2015年第13期180-183,188,共5页

通过对已构建的β-CGTase质粒载体采用一步PCR法进行大片段基因的定点突变,得到三个带有突变位点的质粒载体,并将其进行转化得到突变菌株。分析突变酶的酶学性质并与β-环糊精葡萄糖基转移酶比较,结果表明突变酶酶活力提高到原酶活力的... 通过对已构建的β-CGTase质粒载体采用一步PCR法进行大片段基因的定点突变,得到三个带有突变位点的质粒载体,并将其进行转化得到突变菌株。分析突变酶的酶学性质并与β-环糊精葡萄糖基转移酶比较,结果表明突变酶酶活力提高到原酶活力的1.6倍以上,且突变酶作用的最适温度60℃、最适p H6.0、在60℃下和p H5~8范围内均非常稳定,经方差分析突变酶与原酶的酶学性质差异不显著（p〉0.05）,但是酶活力差异显著（p〈0.05）。 展开更多

关键词 β-环糊精葡糖糖基转移酶 定点突变 环化活性 温度 p H

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产大环糊精4-α-糖基转移酶的分离纯化及其性质研究 被引量：2

3

作者 冀雪霞 王金鹏 +1 位作者 徐学明 金征宇 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期336-341,共6页

4-α-糖基转移酶能够作用直链淀粉产生大环糊精。作者研究了重组E.coliDH-5α-TA(保藏编号:3093)产生的4-α-糖基转移酶的分离纯化及酶学性质。粗酶液经过65℃处理20min、Ni-NTA亲和层析、生物半透膜脱盐得到目标酶,该酶经SDS-PAGE凝胶... 4-α-糖基转移酶能够作用直链淀粉产生大环糊精。作者研究了重组E.coliDH-5α-TA(保藏编号:3093)产生的4-α-糖基转移酶的分离纯化及酶学性质。粗酶液经过65℃处理20min、Ni-NTA亲和层析、生物半透膜脱盐得到目标酶,该酶经SDS-PAGE凝胶电泳呈单一蛋白条带,其相对分子质量为57000。该酶具有较高的转糖基活性且最小作用底物为麦芽糖。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度为75℃,最适pH值为7.5;该酶具有良好的耐热性,在70～85℃酶活维持在80%以上;酶的pH稳定范围为6.0～8.5。 展开更多

关键词 4-α-糖基转移酶 大环糊精 分离纯化 酶学性质

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重组4-α-糖基转移酶转化淀粉制备大元环糊精的条件优化 被引量：1

4

作者 朱荣 宿玲恰 吴敬 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1248-1254,共7页

4-α-糖基转移酶能够以淀粉为底物通过分子内转糖基作用制备大元环糊精。本研究成功构建了产超嗜热菌Aquifex aeolicus来源的4-α-糖基转移酶重组菌的E.coli BL21 (DE3)/pET-24a(+)-AaAM。对重组菌进行摇瓶发酵,培养27h破壁上清酶活达到... 4-α-糖基转移酶能够以淀粉为底物通过分子内转糖基作用制备大元环糊精。本研究成功构建了产超嗜热菌Aquifex aeolicus来源的4-α-糖基转移酶重组菌的E.coli BL21 (DE3)/pET-24a(+)-AaAM。对重组菌进行摇瓶发酵,培养27h破壁上清酶活达到0.99 U/mL。以马铃薯淀粉为底物,对酶转化生成大元环糊精进行了条件优化。结果表明,在底物质量浓度为1 g/dL时,经异淀粉酶脱支预处理后,调节初始pH为7.0,反应温度为75℃,加酶量为20 U/g,在10 h时大元环糊精的转化率达到最高24.8%,为大元环糊精的工业生产奠定了基础。 展开更多

关键词 4-α-糖基转移酶 大元环糊精 酶转化 条件优化

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环糊精葡萄糖基转移酶合成AA-2G反应条件初探 被引量：1

5

作者 何亚妹 刘振杨 +2 位作者 郑婉 苏瑞阳 吴华伟 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第15期203-212,共10页

为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白C... 为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1,经亲和纯化柱纯化并浓缩后,测定其β-环化活性和歧化活性。以维生素C(Vitamin C,V_(C))和β-环糊精为底物,酶法合成AA-2G,并通过单因素优化实验,进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响,对酶合成AA-2G的动力学进行了分析。结果表明:此酶具有合成AA-2G的能力,未优化前AA-2G的产量为0.67 g/L。优化后,考虑到低成本和经济效益,选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体,当糖基供体为可溶性淀粉时,底物浓度为70 g/L,反应pH4.5,反应温度37℃,底物比例3/3(VC/糖基供体),蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为42 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到12.68 g/L;当糖基供体为麦芽糊精时,底物浓度为30 g/L,反应pH5.0,反应温度37℃,底物比例4/2,蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为30 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到4.96 g/L。在最适条件下,AA-2G的产量分别是未优化反应条件下的18.93倍和7.40倍。经动力学分析发现可溶性淀粉作为糖基供体的催化效率高于麦芽糊精,因此,可溶性淀粉作为糖基供体比麦芽糊精更具有优势,合成得到AA-2G的产量更高。本研究成功将重组CGTase-T1用于AA-2G的合成,通过优化酶法合成的反应条件,使AA-2G的产量得到了大幅提高,为实现AA-2G的工业生产提供参考意义。 展开更多

关键词 环糊精葡萄糖基转移酶 2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸 生物酶法 β-环化活性 歧化活性

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蜡状芽孢杆菌环糊精糖基转移酶的基因克隆表达·酶学特性及定点突变研究 被引量：1

6

作者 花敬涵 杨静文 +1 位作者 胡雪芹 张洪斌 《安徽农业科学》 CAS 2019年第5期110-115,126,共7页

研究克隆、表达了蜡状芽孢杆菌来源的环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase,EC 2.4.1.19)基因,研究了其酶学性质,并在此基础上构建突变菌株以探究关键氨基酸位点与产物特异性的关系。结果表明,重组CGTase的最大比... 研究克隆、表达了蜡状芽孢杆菌来源的环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase,EC 2.4.1.19)基因,研究了其酶学性质,并在此基础上构建突变菌株以探究关键氨基酸位点与产物特异性的关系。结果表明,重组CGTase的最大比活力达5 292 U/mL,分子量约为68 kDa,最适温度和pH分别为55℃和8.5;以淀粉为底物催化合成的主要产物是β-环糊精(β-CD);通过序列对比选取了第47位氨基酸(Ala)进行定点突变,构建了A47R、A47M、A47S、A47Y。研究发现活性区域中第47位氨基酸对于产物特异性和产量具有一定的影响,其中亲水性氨基酸更利于CDs(尤其β-CD)的合成,这为酶法合成β-CD的工业应用提供了方法。 展开更多

关键词 β-环糊精糖基转移酶 克隆 表达 定点突变

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GH77家族4-α-糖基转移酶在淀粉改性中应用的研究进展 被引量：2

7

作者 柏玉香 范旭瑶 +2 位作者 王禹 金征宇 刘博群 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第19期242-249,共8页

糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)77家族4-α-糖基转移酶(4-α-glucotransferase,4αGT)由于对α1→4糖苷键的独特作用而被广泛应用于淀粉改性中。4αGT通过分子间转糖基化将淀粉凝胶改性为热可逆淀粉凝胶,还进行分子内转糖基化生产... 糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)77家族4-α-糖基转移酶(4-α-glucotransferase,4αGT)由于对α1→4糖苷键的独特作用而被广泛应用于淀粉改性中。4αGT通过分子间转糖基化将淀粉凝胶改性为热可逆淀粉凝胶,还进行分子内转糖基化生产大环糊精,而且经4αGT处理淀粉的慢消化特性有所改善。4αGT可与分支酶和淀粉蔗糖酶等协同制备更具抗性的α-葡聚糖产品。4αGT改性淀粉在低脂食品、甜味剂和冷冻食品中有着广泛的应用前景,其作为脂肪替代物和乳脂状增强剂添加到蛋黄酱、低脂涂抹酱、搅拌型和凝固型酸奶中,有潜力代替碳水化合物冷冻保护剂成为低甜度冷冻保护剂。全文综述了GH77家族4αGT改性淀粉在应用方面的进展与挑战,为4αGT的工业生产提供参考。 展开更多

关键词 4-α-糖基转移酶 淀粉改性 热可逆淀粉凝胶 大环糊精

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CGTase合成γ-环糊精的酶促反应条件优化 被引量：1

8

作者 曹新志 刘芳 +1 位作者 明红梅 金征宇 《食品与机械》 CSCD 北大核心 2012年第2期196-198,215,共4页

采用筛选到的一株嗜碱芽孢杆菌,研究它所产生的环糊精糖基转移酶生产环糊精的工艺条件,重点探讨酶促反应条件对环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的影响。结果表明:环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的最佳工艺为反应体系的pH 8.0,温度60℃,... 采用筛选到的一株嗜碱芽孢杆菌,研究它所产生的环糊精糖基转移酶生产环糊精的工艺条件,重点探讨酶促反应条件对环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的影响。结果表明:环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的最佳工艺为反应体系的pH 8.0,温度60℃,环糊精糖基转移酶的酶量500U/g.淀粉,甘草酸浓度2%,淀粉的DE值6～11,在该条件下制备的产品得率最高;蕉藕淀粉和木薯淀粉在生产γ-环糊精时是环糊精糖基转移酶比较合适的底物;普鲁蓝酶对γ-环糊精的产量增加作用有限。 展开更多

关键词 嗜碱芽孢杆菌 环糊精糖基转移酶 Γ-环糊精

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大环糊精的酶法制备及应用研究进展 被引量：1

9

作者 谢安宁 金征宇 +1 位作者 李晓晓 柏玉香 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第16期347-357,共11页

大环糊精(large ring cyclodextrin,LR-CD)是由9个至数百个吡喃葡萄糖单元组成的环状α-1,4-葡聚糖,主要通过环糊精葡萄糖基转移酶或4-α-糖基转移酶的环化作用使直链淀粉发生分子内转糖基作用得到。与常见α-、β-、γ-环糊精(cyclodex... 大环糊精(large ring cyclodextrin,LR-CD)是由9个至数百个吡喃葡萄糖单元组成的环状α-1,4-葡聚糖,主要通过环糊精葡萄糖基转移酶或4-α-糖基转移酶的环化作用使直链淀粉发生分子内转糖基作用得到。与常见α-、β-、γ-环糊精(cyclodextrin,CD)相比,LR-CD的空腔尺寸更大,表现出独有的结构和理化特性,这些性质使LR-CD在食品、医药、生物等领域展现出巨大的应用潜力。然而,LR-CD的制备成本高,产率较低,并且缺乏有效的分离纯化方法,因此目前还未实现工业化生产与应用。本文分别从优化底物、设计基于模板诱导的新反应路径、酶分子改造及产物的分离纯化等方面综述酶法制备LR-CD的研究近况与挑战,为LR-CD的工业化生产和应用提供参考。 展开更多

关键词 大环糊精 环糊精葡萄糖基转移酶 4-α-糖基转移酶 淀粉 模板诱导 分子改造

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生物合成葡萄糖基-L-抗坏血酸产酶条件及转化条件优化 被引量：3

10

作者 曹新志 明红梅 《粮食与油脂》 2008年第5期17-20,共4页

采用单因素实验确立微生物发酵法产环糊精糖基转移酶培养基基本条件和工艺条件,利用此酶催化L-抗坏血酸和糖基供体β-环糊精合成葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G),并通过正交实验考察不同加酶量、反应温度、pH等因素,确立环糊精糖基转移酶合... 采用单因素实验确立微生物发酵法产环糊精糖基转移酶培养基基本条件和工艺条件,利用此酶催化L-抗坏血酸和糖基供体β-环糊精合成葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G),并通过正交实验考察不同加酶量、反应温度、pH等因素,确立环糊精糖基转移酶合成产物最佳条件为:在浓度0.04 mol/L L-抗坏血酸,酶量20 ml,pH值7.0,温度50℃下反应15 h。 展开更多

关键词 葡萄糖基-L-抗坏血酸 环糊精糖基转移酶 β-环糊精

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淀粉脱支后环化制备大环糊精 被引量：1

11

作者 许燕 周星 金征宇 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期62-67,共6页

以普通玉米淀粉、木薯淀粉、高直链玉米淀粉为底物制备大环糊精,先利用异淀粉酶将这3种底物脱支处理以后,再利用栖热水生菌4-α-糖基转移酶的环化作用来生产大环糊精。结果表明:经过脱支处理以后,普通玉米淀粉大环糊精的最高转化率从20... 以普通玉米淀粉、木薯淀粉、高直链玉米淀粉为底物制备大环糊精,先利用异淀粉酶将这3种底物脱支处理以后,再利用栖热水生菌4-α-糖基转移酶的环化作用来生产大环糊精。结果表明:经过脱支处理以后,普通玉米淀粉大环糊精的最高转化率从20.3%增加到33.6%(1.7倍);木薯淀粉大环糊精的最高转化率从16.82%增加到32.4%(1.9倍);高直链玉米淀粉大环糊精的最高转化率从24.53%增加到44.07%(1.8倍)。因此,该方法是种有效的大环糊精生产方法,具有工业化应用的潜能。 展开更多

关键词 4-α-糖基转移酶 普通玉米淀粉 木薯淀粉 高直链玉米淀粉 大环糊精

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甜菊糖的酶法改性 被引量：20

12

作者 朱海霞 郑建仙 《中国食品添加剂》 CAS 2004年第1期54-60,共7页

甜菊糖是一种天然的强力甜味剂 ,它的二种组分———甜菊苷和甜菊双糖C苷有苦味和不愉快的后味 ,会显著影响甜菊糖的味质。通过酶改性法在甜菊苷、甜菊双糖C苷中引入一些糖基 ,可以改善甜质。目前酶改性甜菊糖的方法主要有 :环糊精葡糖... 甜菊糖是一种天然的强力甜味剂 ,它的二种组分———甜菊苷和甜菊双糖C苷有苦味和不愉快的后味 ,会显著影响甜菊糖的味质。通过酶改性法在甜菊苷、甜菊双糖C苷中引入一些糖基 ,可以改善甜质。目前酶改性甜菊糖的方法主要有 :环糊精葡糖基转移酶法、β -呋喃果糖苷酶法、半乳糖苷酶法和微生物糖基化法。本论文对这几种酶改性方法作一详细介绍。 展开更多

关键词 甜菊糖 强力甜味剂 酶法改性 环糊精葡糖基转移酶法 β-呋喃果糖苷酶法 半乳糖苷酶法

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双酶法催化玉米淀粉制备γ-CD 被引量：4

13

作者 李林林 张梦柯 +2 位作者 金征宇 王丽华 王金鹏 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期357-363,共7页

以玉米淀粉为底物,研究了来自于栖热水生菌的4α-糖基转移酶(4αGTase)和来自于嗜碱芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉制备γ-CD的影响因素。结果表明:两种酶的添加方式为先加入4αGTase、再加入CGTase;γ-CD的最佳制... 以玉米淀粉为底物,研究了来自于栖热水生菌的4α-糖基转移酶(4αGTase)和来自于嗜碱芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉制备γ-CD的影响因素。结果表明:两种酶的添加方式为先加入4αGTase、再加入CGTase;γ-CD的最佳制备条件为底物质量分数5%,4αGTase加酶量4 U/g淀粉,CGTase加酶量8U/g淀粉,反应时间30 h。在此条件下γ-CD的得率最高为12.83%,比对照组提高了76.7%。 展开更多

关键词 4α-糖基转移酶 环糊精葡萄糖基转移酶 Γ-环糊精 玉米淀粉

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