基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵...基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。展开更多
目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taq...目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。展开更多
本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2...本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp,编码120个氨基酸,与基因库公布的相一致,同源性为100%;经0.8 mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清;利用His标签纯化该蛋白,SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带;Western-blot分析表明,纯化后的chβ2m融合蛋白与特异单克隆抗体反应呈现特异性的条带。以上结果证实,本研究成功表达并获得了纯化的可溶性chβ2m融合蛋白,为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。展开更多
辣椒作为常异花授粉作物,在生产实际中利用核不育两用系进行制种是理想手段。α-微管蛋白(α-tubulin)是细胞骨架的主要成分,与植物育性相关。以辣椒核不育两用系AB114为材料,采用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymor...辣椒作为常异花授粉作物,在生产实际中利用核不育两用系进行制种是理想手段。α-微管蛋白(α-tubulin)是细胞骨架的主要成分,与植物育性相关。以辣椒核不育两用系AB114为材料,采用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技术得到蕾期基因表达差异片段,利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplifi cation of cDNA ends,RACE)技术克隆AFLP-F-57全长。ORF finder分析显示,该基因具有1350 bp的最大开放阅读框,编码450个氨基酸;经Standard Protein BLAST和NCBI Conserved Domain Search鉴定,该基因编码蛋白与烟草、辣椒的α-微管蛋白具有高度相似性,均含有α-tubulin保守结构域,故将其命名为CaTUA基因;RT-PCR分析表明,与可育株相比,不育株中该基因的表达量随花蕾发育呈现下降趋势,于大花蕾时期差异显著;系统进化树分析发现CaTUA蛋白与烟草TUA蛋白序列的进化距离较近。研究初步分析了CaTUA基因的功能,为进一步揭示辣椒核不育与CaTUA的关系提供了理论依据。展开更多
文摘分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisTrapTM HP Columns纯化并做了Western-blot验证,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。
文摘基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。
文摘目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。
文摘本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp,编码120个氨基酸,与基因库公布的相一致,同源性为100%;经0.8 mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清;利用His标签纯化该蛋白,SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带;Western-blot分析表明,纯化后的chβ2m融合蛋白与特异单克隆抗体反应呈现特异性的条带。以上结果证实,本研究成功表达并获得了纯化的可溶性chβ2m融合蛋白,为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。
文摘辣椒作为常异花授粉作物,在生产实际中利用核不育两用系进行制种是理想手段。α-微管蛋白(α-tubulin)是细胞骨架的主要成分,与植物育性相关。以辣椒核不育两用系AB114为材料,采用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技术得到蕾期基因表达差异片段,利用cDNA末端快速扩增(rapid-amplifi cation of cDNA ends,RACE)技术克隆AFLP-F-57全长。ORF finder分析显示,该基因具有1350 bp的最大开放阅读框,编码450个氨基酸;经Standard Protein BLAST和NCBI Conserved Domain Search鉴定,该基因编码蛋白与烟草、辣椒的α-微管蛋白具有高度相似性,均含有α-tubulin保守结构域,故将其命名为CaTUA基因;RT-PCR分析表明,与可育株相比,不育株中该基因的表达量随花蕾发育呈现下降趋势,于大花蕾时期差异显著;系统进化树分析发现CaTUA蛋白与烟草TUA蛋白序列的进化距离较近。研究初步分析了CaTUA基因的功能,为进一步揭示辣椒核不育与CaTUA的关系提供了理论依据。
