利用改良SOE-PCR技术定点突变TuMVC4-VPg基因 被引量：3

1

作者 李国亮 钱伟 +7 位作者 张淑江 李菲 章时蕃 张慧 谢露露 武剑 王晓武 孙日飞 《中国蔬菜》 北大核心 2017年第10期39-44,共6页

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VP... 芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VPg基因序列为模板,定点突变Tu MV C4-VPg与Tu MV CDN1-VPg基因间5个差异核苷酸位点(决定5个氨基酸差异)。结果表明:通过SOE-PCR技术获得了5个Tu MV C4-VPg基因的单点突变体,即Tu MV C4-VPg-Ⅰ、Tu MV C4-VPg-Ⅱ、Tu MV C4-VPg-Ⅲ、Tu MV C4-VPg-Ⅳ和Tu MV C4-VPg-Ⅴ。 展开更多

关键词 白菜类蔬菜 芜菁花叶病毒 VPg基因 重叠延伸PCR技术 单点突变

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SOEing法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达 被引量：1

2

作者 李杰 闫红霞 +3 位作者 曲东京 刘红涛 鲁照明 薛乐勋 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期546-551,共6页

通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOEing)构建含有杜氏盐藻(Dunaliella salina)硝酸盐还原酶(NR)基因5′-上游序列(Pnr)and 3′-端序列(Tnr)的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,... 通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOEing)构建含有杜氏盐藻(Dunaliella salina)硝酸盐还原酶(NR)基因5′-上游序列(Pnr)and 3′-端序列(Tnr)的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,将杜氏盐藻NR基因Pnr与报告基因EGFP cDNA融合,并与pEGM-7zf克隆载体连接,顺序将盐藻NR基因Tnr序列与融合片段相连,构建含Pnr-EGFP-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NET。电击法转化杜氏盐藻,在盐藻转化株中观察到了EGFP的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了实验基础。 展开更多

关键词 杜氏盐藻 重叠区扩增基因拼接法(soeing) 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 真核表达载体

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抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达 被引量：20

3

作者 王秀青 张素芳 +2 位作者 曹瑞兵 周斌 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期120-123,共4页

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电... 通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。 展开更多

关键词 天蚕素B 抗菌肽 毕赤酵母 表达 抑菌活性 重叠区扩增基因拼接法(soe)

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猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究 被引量：11

4

作者 闫若潜 吴志明 +3 位作者 张志凌 盛敏 刘光辉 赵明军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期248-255,共8页

为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleuk... 为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达。通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性。结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104I U.mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U.mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应。这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪Α干扰素 猪白细胞介素2 重叠延伸PCR 嵌合基因 融合表达 活性

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利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2 Bnap全长cDNA序列 被引量：3

5

作者 李德谋 罗小英 +3 位作者 侯磊 裴炎 方卫国 杨光伟 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期553-555,共3页

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理 ,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增 ,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cD NA序列。

关键词 交错延伸剪接PCR 花粉育性基因MS2Bnap 全长CDNA序列 油菜 植物

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鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用 被引量：5

6

作者 徐重新 张霄 +6 位作者 张存政 刘媛 仲建锋 董飒 胡晓丹 林曼曼 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第1期210-217,共8页

构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸... 构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。 展开更多

关键词 噬菌体展示库 单链抗体 重叠延伸PCR 噬菌粒载体 BT毒素

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大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定 被引量：11

7

作者 宋柬 马会勤 +2 位作者 郝佳 任发政 陈尚武 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第7期29-35,共7页

利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉... 利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。 展开更多

关键词 苯丙氨酸解氨酶(PAL) pET-31b(+) 基因克隆 重组表达 肉桂酸

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重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用 被引量：4

8

作者 易平勇 余海 +2 位作者 马文学 孙文均 姜槐 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2003年第5期412-414,共3页

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼... 目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌肠毒素A 碱性磷酸酶 重叠区扩增基因拼接法

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重叠区扩增法合成抗菌肽B基因 被引量：9

9

作者 桑春果 张开春 张军科 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2002年第1期65-67,共3页

人工设计并合成了抗菌肽 B基因的 4个寡聚核苷酸片段 ,通过重叠区扩增法 ,扩增出了相当于抗菌肽基因全长的寡聚核苷酸片段。经克隆测序 ,证明成功地实现了抗菌肽基因的人工合成、拼接和克隆。

关键词 重叠区扩增法 抗菌肽 基因合成 基因克隆

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抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达 被引量：3

10

作者 朱慧芬 杨道锋 +1 位作者 沈关心 周春 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期402-404,408,共4页

目的　构建抗转铁蛋白受体 (TfR)单链抗体原核表达载体 ,为进一步研究其效应奠定基础。方法　从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体 pGEM T VH和 pGEM T VL中扩增重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VL)基因 ,用重叠延伸PCR的方... 目的　构建抗转铁蛋白受体 (TfR)单链抗体原核表达载体 ,为进一步研究其效应奠定基础。方法　从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体 pGEM T VH和 pGEM T VL中扩增重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VL)基因 ,用重叠延伸PCR的方法 ,在VH和VL基因间引入连接短肽 (Linker) ,构建VH Linker VL的单链抗体 (singlechainFv ,scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上 ,转化和筛选后 ,阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法 (IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果　凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约 70 0bp条带 ,SDS PAGE鉴定表达产物的分子量为 2 7kD左右 ,与scFv的理论值一致 ,IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论　本研究成功地构建并表达了抗人TfRscFv ,为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 抗转铁蛋白受体 单链抗体 原核表达 跨膜糖蛋白

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利用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因构建dsRNA原核表达体系 被引量：6

11

作者 尹国华 刘楠 +3 位作者 孙兆楠 宋云枝 朱常香 温孚江 《山东农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第3期317-324,共8页

大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得... 大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得了RNaseIII缺失型菌株M-origami。利用电激法,将构建的TMV运动蛋白基因(movement protein gene,MP)的dsRNA表达载体LMP480导入M-origami菌株中,IPTG诱导表达的结果显示:构建的M-origami/LMP480原核表达系统能高效表达TMV运动蛋白基因的dsRNA。初步的抗病性鉴定显示,表达的dsRNA能够诱发烟草对TMV的抗性。 展开更多

关键词 RED重组系统 重叠延伸PCR RNaseIII缺失菌株 DSRNA 病毒抗性

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乙型肝炎病毒基因生物信息学分析及特异片段的制备 被引量：2

12

作者 徐晓雪 房凯 +4 位作者 钟连声 潘忠诚 李超 胥威 赵雨杰 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期583-585,共3页

目的制备HBV基因分型芯片模板。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对,选取6个碱基位点作为分型位点,应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing法)对C型HBV片段进行点突变。结果在所选位点上成功引入点突变。结论SOEing法是一种简便引入点... 目的制备HBV基因分型芯片模板。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对,选取6个碱基位点作为分型位点,应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing法)对C型HBV片段进行点突变。结果在所选位点上成功引入点突变。结论SOEing法是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型检测基因所需的模板DNA。 展开更多

关键词 重叠区扩增基因拼接法 乙型肝炎病毒 基因分型

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修饰GLP2分泌性表达载体的构建及促增殖活性测定的实验研究 被引量：3

13

作者 谭虎 杨天德 +5 位作者 粟永萍 艾国平 黄岚 陶军 刘晓宏 楼淑芬 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第17期1650-1653,共4页

目的对胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptid-2,GLP-2)进行基因修饰,观察其促细胞增殖活性。方法通过RT-PCR方法获得含GLP2编码序列的高血糖素原cDNA片段;通过PCR重叠延伸技术得到GLP2信号肽及成熟肽的嵌合分子,并将编码GLP2成熟肽N-... 目的对胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptid-2,GLP-2)进行基因修饰,观察其促细胞增殖活性。方法通过RT-PCR方法获得含GLP2编码序列的高血糖素原cDNA片段;通过PCR重叠延伸技术得到GLP2信号肽及成熟肽的嵌合分子,并将编码GLP2成熟肽N-末端第二位丙氨酸的序列(GCT)突变为编码甘氨酸的序列(GGT);将其插入真核表达质粒pVITRO3,转染至肠上皮细胞(Caco-2),观察其对细胞增殖活性的影响。结果克隆的修饰GLP2基因与国外报道的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列完全一致,并成功拼接GLP2的信号肽及成熟肽;且加入pVITRO3-GLP2-Caco-2培养上清的细胞生长明显快于对照组。结论PCR重叠延伸技术适用于分泌性载体构建。构建的修饰GLP2表达系统所表达的蛋白具有促进肠上皮细胞增殖的作用。 展开更多

关键词 胰高血糖素样肽-2 基因克隆 PCR重叠延伸技术 肠上皮 细胞增殖

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人角质细胞生长因子的植物表达载体构建 被引量：3

14

作者 苏勇波 邵寒娟 +2 位作者 沈明山 王鸣刚 陈亮 《兰州大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期25-28,共4页

人角质细胞生长因子(KGF)有3个外显子,2个内含子．以人 DNA 为模板,PCR 扩增获得角质细胞生长因子外显子2和外显子3；合成单链的寡核苷酸,经链延伸和 PCR 扩增从而获得外显子1．应用延伸 PCR 将3个外显子连接得 KGF 编码序列,并连接 CaM... 人角质细胞生长因子(KGF)有3个外显子,2个内含子．以人 DNA 为模板,PCR 扩增获得角质细胞生长因子外显子2和外显子3；合成单链的寡核苷酸,经链延伸和 PCR 扩增从而获得外显子1．应用延伸 PCR 将3个外显子连接得 KGF 编码序列,并连接 CaMV35S 启动子和 NOS 终止子后克隆至植物表达质粒 pBI 1301． 展开更多

关键词 角质细胞生长因子 植物表达载体 重叠延伸法

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牛IL-2cDNA缺失突变的矫正及表达产物生物学活性测定 被引量：2

15

作者 李春华 李祥瑞 +3 位作者 魏晓锋 徐立新 李震 陈芳 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期86-89,共4页

根据GenBank中的牛IL 2基因序列 ,设计一对引物Pa和Pd ,以牛外周血淋巴细胞为材料 ,用RT PCR方法扩增得到牛IL 2cDNA ,测序发现在扩增产物的第 2 4 0位缺失了一个A碱基。采用重叠延伸剪接术 (SOE法 )向突变体定点插入该碱基 ,然后与表... 根据GenBank中的牛IL 2基因序列 ,设计一对引物Pa和Pd ,以牛外周血淋巴细胞为材料 ,用RT PCR方法扩增得到牛IL 2cDNA ,测序发现在扩增产物的第 2 4 0位缺失了一个A碱基。采用重叠延伸剪接术 (SOE法 )向突变体定点插入该碱基 ,然后与表达载体连接 ,获得了正确的表达产物。经RT PCR检测证明 ,重组的牛IL 2蛋白具有较好的生物学活性 ,能诱导肿瘤坏死因子TNF α和干扰素IFN γ的产生。 展开更多

关键词 牛 IL-2 cDNA缺失突变体 矫正 基因表达 定点突变 生物学活性 重叠延伸剪接术 白细胞介素2

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微小隐孢子虫三个基因主要抗原表位区的串联表达及其抗原性分析 被引量：4

16

作者 秦培兰 李艳 +7 位作者 米荣升 呼高伟 黄燕 周鹏 张国恩 苏庆美 曹薇 陈兆国 《中国动物传染病学报》 CAS 2012年第3期36-43,共8页

应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞表位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将... 应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的氨基酸序列进行T细胞表位预测及分析,从中选取了三个抗原表位富集的基因片段,利用重叠延伸PCR(gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)将该三个基因片段串联在一起,各基因片段之间以柔性氨基酸(GGGGS)碱基序列链接,得到的拼接片段命名为CpTm。将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-CpTm,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果成功地构建了CpTm串联基因并在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,质谱分析表明重组表达蛋白包含了上述三个抗原的氨基酸序列。Western blot分析显示该重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP15、P23、CP15/60基因重组表达蛋白免疫兔血清识别,制备的抗血清能被重组蛋白特异性识别,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为多表位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 微小隐孢子虫 抗原表位 重叠延伸PCR 原核表达 抗原性

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禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化 被引量：2

17

作者 杨金国 王聃 +10 位作者 刘慧芳 杜艳芬 司微 赵海玲 林靖凯 王春来 倪红波 赫明雷 彭玮 赵福广 刘思国 《中国动物传染病学报》 CAS 2009年第2期59-62,共4页

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(SOE-PCR)获得了融... 为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(SOE-PCR)获得了融合基因22-ag85B,将基因连接于表达载体pET32a(+),构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1mmol/L)诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。 展开更多

关键词 禽分枝杆菌副结核亚种 22KD基因 ag85B基因 重叠延伸剪接技术 重组表达

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利用重叠PCR技术对OsAMT1.2进行定点突变 被引量：2

18

作者 李宝珍 李素梅 +1 位作者 施卫明 苏彦华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期69-72,共4页

铵是植物吸收利用的主要氮源之一,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用。为了深入研究水稻铵转运蛋白的结构功能特性,利用重叠PCR技术对OsAMT1.2蛋白质序列中保守的253 aa和257 aa的苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S)分别突变为... 铵是植物吸收利用的主要氮源之一,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用。为了深入研究水稻铵转运蛋白的结构功能特性,利用重叠PCR技术对OsAMT1.2蛋白质序列中保守的253 aa和257 aa的苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S)分别突变为丙氨酸,成功获得了相应的2个点突变基因。因此,重叠PCR技术是一种简单有效的进行体外基因重组和突变的方法,对于研究高等植物功能基因的结构功能特性具有重要的意义。 展开更多

关键词 水稻 铵转运蛋白 OsAMT1.2 点突变 重叠PCR

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CryIA(c)和gna融合基因植物表达载体的构建 被引量：5

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作者 冯翠莲 张树珍 《热带作物学报》 CSCD 2010年第2期224-228,共5页

采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR),通过连接多肽FMDV2A序列将CryIA(c)和gna基因相融合,得到CryIA(c)-2A-gna抗虫融合基因。并进一步将玉米UBI启动子和融合基因(CryIA(c)-2A-gna)分别连接到植... 采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR),通过连接多肽FMDV2A序列将CryIA(c)和gna基因相融合,得到CryIA(c)-2A-gna抗虫融合基因。并进一步将玉米UBI启动子和融合基因(CryIA(c)-2A-gna)分别连接到植物表达载体pCAMBIA3300上,构建成由玉米UBI启动子驱动抗虫融合基因的植物表达载体pNUBG。经过限制性酶切分析鉴定,结果表明,含有融合基因的植物表达载体构建成功。 展开更多

关键词 重叠延伸PCR FMDV2A 融合基因 表达载体

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抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达

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作者 代维 刘静 +5 位作者 黄鹤 文雪 袁晓梅 雷萍 朱慧芬 沈关心 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期936-939,共4页

目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达。方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamHⅠ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP... 目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达。方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamHⅠ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性。结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合。结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性。 展开更多

关键词 转铁蛋白受体 单链抗体 重叠延伸PCR

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