融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展 被引量：16

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作者 吴珊珊 朱芸 +1 位作者 陈珊珊 何冰芳 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第4期993-998,共6页

融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白... 融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白折叠中的作用,其中大多数功能较强的融合标签(如MBP和NusA)作为分子伴侣帮助重组蛋白正确折叠从而提高蛋白质可溶性。此外,阐述了实际应用中常用的组合标签和标签的去除。最后提出了融合标签在大规模生产可溶性蛋白质中的应用前景、面临的挑战,以及今后研究的方向。 展开更多

关键词 生物技术 蛋白 溶解性 融合标签 重组蛋白质 可溶性表达 纯化

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重组人胰高血糖素样肽-1的表达、纯化及其生物学活性 被引量：11

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作者 张志珍 杨生生 毛积芳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期5-8,共4页

为获得重组人胰高血糖素样肽 1[recombinanthumanglucagon likepeptide 1(7～ 37) ,rhGLP 1]并研究其生物学活性 ,采用亚磷酸二酯法合成hGLP 1cDNA的 6个寡核苷酸片段 ,拼接成完整的hGLP 1cDNA ,构建重组质粒pGEX hGLP 1,转化大肠杆菌B... 为获得重组人胰高血糖素样肽 1[recombinanthumanglucagon likepeptide 1(7～ 37) ,rhGLP 1]并研究其生物学活性 ,采用亚磷酸二酯法合成hGLP 1cDNA的 6个寡核苷酸片段 ,拼接成完整的hGLP 1cDNA ,构建重组质粒pGEX hGLP 1,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达菌株 .高密度发酵培养的菌体超声破碎后 ,裂解液用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化得到GST融合蛋白 .经CNBr裂解、QAE SepharoseFF柱层析和脱盐 ,得到纯度大于 90 %的rhGLP 1,质谱测定分子量结果与理论值一致 .生物学活性分析表明 ,rhGLP 1具有明显的降血糖活性 . 展开更多

关键词 重组人胰高血糖素样肽-1 融合蛋白 纯化 生物学活性 表达

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鲤鱼重组IL-17N的原核表达条件优化及蛋白纯化 被引量：4

3

作者 张磊 唐永凯 +3 位作者 李红霞 徐逾鑫 李迎宾 俞菊华 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期364-369,共6页

为获得可溶的鲤鱼IL-17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST-17N、SUMO-GST-17N和MBP-17N,确定IL-17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL-17... 为获得可溶的鲤鱼IL-17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST-17N、SUMO-GST-17N和MBP-17N,确定IL-17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL-17N原核重组表达载体GST-17N、SUMO-GST-17N和MBP-17N;融合标签MBP、SUMO-GST和GST的促溶效果依次降低,SUMO-GST-17N、MBP-17N上清蛋白占总蛋白比例分别为47.4%、87.0%;MBP-17N的最佳表达条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导8~12 h;经过镍柱纯化,获得可溶MBP-17N蛋白,每克总菌约获得0.09 mg MBP-17N蛋白。 展开更多

关键词 鲤鱼 白细胞介素17N 原核表达 重组蛋白 融合标签 蛋白纯化

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人甲状旁腺素(1-34)衍生物在大肠杆菌中表达、纯化及其生物学活性 被引量：4

4

作者 狄旭 刘长征 +4 位作者 陈松森 张艳丽 邓艳春 孙兰 杨京 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期227-233,共7页

为研究Gly hPTH(1 34)衍生物的生物学活性 ,用重叠PCR方法合成编码hPTH(1 34)的DNA片段 ,克隆到融合表达载体pGEX 2T的缩短型谷胱甘肽转移酶基因GST6 9△的 3′末端 ,构建正确读码框架的融合基因 .在两个基因间引入蛋白质羟胺切割位点序... 为研究Gly hPTH(1 34)衍生物的生物学活性 ,用重叠PCR方法合成编码hPTH(1 34)的DNA片段 ,克隆到融合表达载体pGEX 2T的缩短型谷胱甘肽转移酶基因GST6 9△的 3′末端 ,构建正确读码框架的融合基因 .在两个基因间引入蛋白质羟胺切割位点序列 ,转入E .coliJM10 9中 ,IPTG诱导表达 .该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 2 0 %以上 ,主要以包涵体形式存在 ,盐酸羟胺切割表达产物 .分析表明 ,80 %左右的融合蛋白被裂解为GST6 9△和Gly hPTH(1 34) .经分子筛柱层析和反相层析分离纯化获得重组Gly hPTH(1 34)衍生物 ,纯度达 98%以上 ,回收率约为 10mg/升发酵液 ,分子量为 4 177,等电点 (pI)为 8 4 0 ,N端 16个氨基酸 ,除第一个为甘氨酸外 ,其余与天然hPTH(1 34)序列一致 .Western印迹结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物具有hPTH(1 34)的免疫学活性 .体外活性测定结果表明 ,Gly hPTH(1 34)衍生物能刺激人成骨细胞HOSTE85增殖、增加细胞内胶原合成、ALP活性增高和cAMP生成量增加 ,并呈量效关系 ,提示它具有与化学合成的hPTH(1 34)相同的生物学活性 ,N端多一个Gly对其活性无明显影响 . 展开更多

关键词 Gly—hPTH(1—34)衍生物 融合表达 羟胺切割 纯化 生物学活性

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乳源抗菌-免疫调节融合蛋白原核表达和纯化 被引量：2

5

作者 江良梁 秦宜德 +2 位作者 周艳 王超 刘滋康 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2008年第3期260-263,共4页

目的构建乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)与免疫调节肽(PGPIPN)融合肽表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达及纯化。方法采用重叠延伸PCR技术获得融合肽基因片段,并构建到原核表达载体pGEX-KG中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌B... 目的构建乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)与免疫调节肽(PGPIPN)融合肽表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达及纯化。方法采用重叠延伸PCR技术获得融合肽基因片段,并构建到原核表达载体pGEX-KG中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。用Glutathione Sepharose4B亲和层析方法纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pGEX-KG-FP,并在大肠杆菌BL21中诱导其高表达。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗GST单克隆抗体所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。经Glutathione Sepharose4B纯化后,得到较纯的GST-FP融合蛋白。结论构建了原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该融合蛋白。 展开更多

关键词 大肠杆菌 肽类/遗传学 基因表达 重组融合蛋白 质类

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抗冻蛋白AFPⅢ的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 被引量：2

6

作者 郝凤霞 胡文革 +2 位作者 付伟超 康庄丽 张桂玲 《水产科学》 CAS 北大核心 2009年第11期671-674,共4页

采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果。用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体... 采用基因重组技术将AFPⅢ基因与原核表达载体pET32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果。用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫6-7周龄的小白鼠,制备AFPⅢ多克隆抗体,采用Western印迹法检验抗体特异性。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度。成功地构建了AFPⅢ的原核表达载体,经在大肠杆菌中诱导表达、镍柱亲和层析纯化,得到较纯的相对分子质量约26 000 Da的融合蛋白,免疫小白鼠后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPⅢ蛋白特异性结合。该试验为进一步研究AFPⅢ在转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础。 展开更多

关键词 抗冻蛋白 原核表达 重组融合蛋白 纯化 抗体

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重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定 被引量：2

7

作者 陈检 杨可 +7 位作者 郭珍 张阳丽 张绍城 杨伟 赵沙沙 何泉 汪德强 周建中 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1208-1211,共4页

目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒... 目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。 展开更多

关键词 重组葡激酶 人HC蛋白 融合蛋白 表达纯化 体外活性

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GST-GnRH/TRS融合蛋白(包涵体)的分离、纯化与复性研究 被引量：2

8

作者 金元昌 陈春岚 +3 位作者 苏晓艳 李会东 令玉林 李景鹏 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期173-176,共4页

以人工合成的促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone,GnRH)/转运肽(TRS)基因与表达载体pGEX-6p-1相连的重组子(pGE-G)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(ED3)plyS。本文对GST-GnRH/TRS/BL21(DE3)plyS工程菌的GST-GnRH/TRS重... 以人工合成的促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone,GnRH)/转运肽(TRS)基因与表达载体pGEX-6p-1相连的重组子(pGE-G)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(ED3)plyS。本文对GST-GnRH/TRS/BL21(DE3)plyS工程菌的GST-GnRH/TRS重组产物进行了诱导表达和分离纯化的研究,结果表明,该工程菌用LB培养基在30℃扩增至OD590为0.6左右,加IPTG(终浓度为0.2 mmol/L)诱导3.5h,此时GST-GnRH/TRS的表达量可占菌体总蛋白的33.3%。重组产物绝大多数以IBs形式存在于菌体中。工程菌经溶菌酶破碎、高速离心,得IBs粗制品后,再用8 mL 1%(V/V)Triton X-100变性溶解IBs,离心取上清,进行Glutathione Sepharose 4B柱一步法亲和层析,得到了纯度较高的GST-GnRH/TRS融合蛋白,为进一步研究和实际应用奠定基础。 展开更多

关键词 GNRH 融合蛋白 分离纯化与复性

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人表皮生长因子-天花粉蛋白融合蛋白的基因克隆、表达及纯化 被引量：2

9

作者 李咏梅 杨海文 罗仁 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期205-207,共3页

目的构建人表皮生长因子(EGF)-linker-天花粉蛋白(TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-linker-TCS融合蛋白。方法用PCR方法扩增EGF及柔性连接肽Linker基因片段,插入质粒PQE30-TCS中,转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(... 目的构建人表皮生长因子(EGF)-linker-天花粉蛋白(TCS)融合蛋白的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化EGF-linker-TCS融合蛋白。方法用PCR方法扩增EGF及柔性连接肽Linker基因片段,插入质粒PQE30-TCS中,转化至大肠杆菌M15中,表达该融合蛋白(EGF-linker-TCS)。表达产物经Ni-NTAAgrose亲和层析柱纯化。结果PQE30-EGF-linker-TCS蛋白在大肠杆菌M15中获得稳定、高效的融合表达。目的蛋白占细胞总蛋白的40%左右,以可溶性形式存在,表达上清柱纯化后纯度达95%以上。结论应用基因工程技术,成功地构建了融合蛋白EGF-linker-TCS的表达载体,表达并纯化了该融合蛋白,为进一步研究其结构功能关系和肿瘤临床应用奠定了基础。 展开更多

关键词 表皮生长因子 天花粉蛋白 重组融合蛋白 纯化

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新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化 被引量：1

10

作者 关海容 孙玉英 +6 位作者 袁志宏 张惠丽 梁飞 刘楠 郭斯启 习彩霞 奚永志 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第1期123-127,共5页

为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结... 为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过Ni-NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性,经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%。Western-blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTT生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。 展开更多

关键词 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 蛋白纯化 靶向杀伤 生物活性

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重组沙蚕激酶的诱导表达和分离纯化 被引量：1

11

作者 黄琳 王斌 李荣贵 《天然产物研究与开发》 CAS CSCD 2008年第1期37-40,共4页

将已构建好的表达载体pGEX-4T-2SAK转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合的沙蚕激酶蛋白,通过GST树脂亲和吸附和凝血酶酶切及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,用SDS-PAGE分析要重组的目的蛋白及纯化后的蛋白。纯化后的沙蚕激酶... 将已构建好的表达载体pGEX-4T-2SAK转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合的沙蚕激酶蛋白,通过GST树脂亲和吸附和凝血酶酶切及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,用SDS-PAGE分析要重组的目的蛋白及纯化后的蛋白。纯化后的沙蚕激酶经纤维平板法测定具有溶栓活性。冷冻干燥品经SDS-PAGE分析表明达到电泳纯。 展开更多

关键词 沙蚕激酶 重组融合蛋白 分离纯化

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白血病 BCR-ABL 融合基因逆转录 PCR 检测中的实验因素探讨 被引量：4

12

作者 李巍 杜传书 《中山医科大学学报》 CSCD 1997年第2期96-99,共4页

建立白血病中费城（Ｐｈ）染色体上独特的ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因的逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）快速检测方法。利用正交设计原理优化逆转录反应条件，探讨该法中引物设计和嵌套式ＰＣＲ对检测灵敏度的影响，利用扩增产物所含限制性酶... 建立白血病中费城（Ｐｈ）染色体上独特的ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因的逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）快速检测方法。利用正交设计原理优化逆转录反应条件，探讨该法中引物设计和嵌套式ＰＣＲ对检测灵敏度的影响，利用扩增产物所含限制性酶切位点进行产物特异性鉴定。运用此法检测１２例慢性粒细胞白血病，除１例阴性外，其余１１例阳性标本含不同类型（ｂ３ａ２，ｂ２ａ２，Ｂ１ａ２）ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ。讨论了用于临床标本检测中应考虑的问题。 展开更多

关键词 白血病 遗传学 融合蛋白质 BCR-ABL

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多肽pd20与肿瘤坏死因子α融合蛋白的纯化及生物学活性鉴定

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作者 呼圣娟 姜荣兴 +2 位作者 师红利 沈皓 谢华红 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第12期1358-1361,1365,共5页

背景多肽pd20是具有胃癌肝转移导向性的新多肽分子,为研究其是否具有携带抗癌药物或抑癌基因靶向性治疗胃癌肝转移的作用,本研究将其与肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行基因融合,构建原核表达载体,对重组融合蛋白进行诱导表达。目的将pd20-T... 背景多肽pd20是具有胃癌肝转移导向性的新多肽分子,为研究其是否具有携带抗癌药物或抑癌基因靶向性治疗胃癌肝转移的作用,本研究将其与肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行基因融合,构建原核表达载体,对重组融合蛋白进行诱导表达。目的将pd20-TNF-α融合蛋白进行蛋白纯化,并对纯化后蛋白进行鉴定和生物学活性检测。方法用Ni-NTA柱法纯化pd20-TNF-α融合蛋白并进行Western blotting检测;采用L929细胞毒法进行pd20-TNF-α融合蛋白的生物学活性检测;用流式细胞术检测不同浓度融合蛋白作用于胃癌肝高转移潜能细胞XGC9811-L的早期凋亡率,此实验分为5组:pd20-TNF-α100.00、25.00、6.25 U/ml分别为A、B、C组,不加融合蛋白的为D组,流式细胞凋亡的KB组为E组;细胞侵袭实验观察融合蛋白对胃癌肝高转移潜能细胞XGC9811-L转移能力的影响,此实验分为4组:pd20-TNF-α组、TNF-α组、XGC9811-L组和对照肽组。结果通过Ni-NTA柱纯化,在咪唑浓度为200 mmol/L时获得纯化的目标pd20-TNF-α融合蛋白,蛋白纯度可达92%;纯化后的蛋白具有与抗TNF-α单抗结合的能力。L929细胞毒法显示:pd20-TNF-α融合蛋白对L929细胞有明显的杀伤力,杀伤活性可达7.6×106U/ml。凋亡实验显示:A^E 5组细胞早期凋亡率间有差异〔(9.04±0.08)%、(6.96±1.21)%、(5.99±0.02)%、(0.73±0.02)%、(0.01±0.00)%;F=2.57,P<0.05〕。细胞侵袭实验显示:pd20-TNF-α组、TNF-α组、XGC9811-L组、对照肽组单位时间内的穿膜细胞数有差异〔(26.5±5.9)、(36.0±3.2)、(63.5±5.0)、(64.0±6.8)个;F=49.87,P<0.01〕。结论本研究成功纯化了pd20-TNF-α融合蛋白,并证实该蛋白有明显的生物学活性,具有促进胃癌细胞早期凋亡和抑制胃癌细胞侵袭的能力。 展开更多

关键词 融合蛋白质类 pd20 肿瘤坏死因子Α 纯化 生物学活性

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家蚕血淋巴液中重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的制备纯化及鉴定

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作者 舒鸿钧 沈倍奋 +3 位作者 秦浚川 韩慧婉 赵睿 刘国诠 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1999年第7期45-49,共5页

为探索适于昆虫表达体系重组蛋白质的分离、纯化方法，对家蚕细胞表达的重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）的纯化工艺进行了研究。利用离子交换色谱、凝胶过滤色谱及旋转等电聚焦电泳等技术，建立了从家蚕血淋巴... 为探索适于昆虫表达体系重组蛋白质的分离、纯化方法，对家蚕细胞表达的重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）的纯化工艺进行了研究。利用离子交换色谱、凝胶过滤色谱及旋转等电聚焦电泳等技术，建立了从家蚕血淋巴液中分离、纯化ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的工艺路线。经过三步分离，获得了纯度为９７．２４％的目标产品，总回收率达３３．５９％。此法可有效地去除动、植物色素且简单、经济、高效，适于进行规模放大，为ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的大规模制备及临床应用打下了基础。 展开更多

关键词 基因重组 蛋白质 分离纯化 家蚕 GM-CSF

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重组大鼠14-3-3γ蛋白在大肠杆菌中的融合表达与分离纯化

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作者 彭少君 何明 周复辉 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第1期58-60,共3页

目的:利用分子克隆技术在原核细胞中研究14-3-3γ融合蛋白的表达及分离纯化。方法:采用RT-PCR法从大鼠心肌组织中扩增14-3-3γcDNA编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-KG中,免疫印迹法检测表达产物。结果:... 目的:利用分子克隆技术在原核细胞中研究14-3-3γ融合蛋白的表达及分离纯化。方法:采用RT-PCR法从大鼠心肌组织中扩增14-3-3γcDNA编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-KG中,免疫印迹法检测表达产物。结果:经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达,表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的27.08%,相对分子质量为56000左右。能与抗鼠14-3-3γ多克隆抗体特异性结合。结论:表明成功构建了GST-14-3-3γ融合蛋白载体,在大肠杆菌中有高效表达,并具有良好的免疫反应性。 展开更多

关键词 重组14—3—3γ蛋白 原核表达 GST-融合蛋白 分离纯化 多克隆抗体 大鼠

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利用pET-29b载体进行葡激酶基因表达与其产物的亲和纯化 被引量：3

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作者 吴樱 黄鹤 +1 位作者 周加文 甘一如 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期865-867,877,共4页

目的 :探讨 6聚组氨酸序列与葡激酶基因序列融合表达及其表达产物的纯化方法。方法 :将葡激酶的c DNA序列连入 p ET- 2 9b质粒 ,转入 E.coli BL 2 1(DE3)进行表达。应用镍金属离子螯合层析及凝胶过滤层析法纯化表达产物 ,采用溶圈法对... 目的 :探讨 6聚组氨酸序列与葡激酶基因序列融合表达及其表达产物的纯化方法。方法 :将葡激酶的c DNA序列连入 p ET- 2 9b质粒 ,转入 E.coli BL 2 1(DE3)进行表达。应用镍金属离子螯合层析及凝胶过滤层析法纯化表达产物 ,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果 :6聚组氨酸与葡激酶的可溶性融合蛋白在 BL 2 1(DE3)中的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的 2 5 % ;螯合层析纯化后其纯度可达 90 %以上 ;再应用 Sephacryl S-2 0 0 HR可使其纯度提高到 98%以上 ;测得其比活性为 5 .0× 10 4 AU· m g- 1 。结论 :利用 p ET- 2 9b载体成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的亲和纯化。 展开更多

关键词 葡糖激酶 重组蛋白质类 生物合成 重组融合蛋白质类 分离和纯化 组氨酸 色谱法 亲和 色谱法 凝胶

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牡蛎过敏原肌浆钙结合蛋白的分离纯化和鉴定 被引量：3

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作者 程青丽 李国明 +5 位作者 赵晓涵 冯晓文 卢知浩 谷瑞增 鲁军 刘文颖 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第16期15-21,共7页

利用质谱鉴定从太平洋牡蛎肌浆里提取的单一蛋白,通过免疫印迹分析诱导表达的重组蛋白和之前已鉴定的天然蛋白的分子质量一致性,利用圆二色光谱分析两蛋白在二级结构上的一致性,鉴定牡蛎肌浆钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding pr... 利用质谱鉴定从太平洋牡蛎肌浆里提取的单一蛋白,通过免疫印迹分析诱导表达的重组蛋白和之前已鉴定的天然蛋白的分子质量一致性,利用圆二色光谱分析两蛋白在二级结构上的一致性,鉴定牡蛎肌浆钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)糖蛋白类型并测定其多糖含量。结果表明,从牡蛎粗提物中纯化20 kDa蛋白,经LC-MS/MS证实为牡蛎肌浆钙结合蛋白SCP;电泳得到天然SCP和重组SCP分别为20 kDa和22 kDa的条带;测定二者α螺旋和β折叠含量分别为13.5%、18.9%以及14.5%、18.2%;SCP蛋白含O-糖苷键型糖多糖,含量为7.89%。重组SCP与天然SCP除分子质量稍有差异外,二者空间结构近乎相同,是太平洋牡蛎中新型潜在致敏原。该研究为今后用重组SCP替代天然SCP进行致敏性和致敏机制研究奠定了基础。 展开更多

关键词 太平洋牡蛎 肌浆钙结合蛋白 重组表达 分离纯化 糖蛋白

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幽门螺杆菌HspA-UreB融合蛋白包涵体的纯化及活性鉴定 被引量：2

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作者 纪晋文 代丽萍 +1 位作者 段广才 郗园林 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期256-258,共3页

目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白 A亚单位 -尿素酶 B亚单位 (Hsp A- Ure B)融合蛋白包涵体的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌 BL2 1(p ET- HU2 7)诱导表达的 Hsp A- Ure B融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性 ,在 A¨... 目的 :建立一种有效的纯化幽门螺杆菌热休克蛋白 A亚单位 -尿素酶 B亚单位 (Hsp A- Ure B)融合蛋白包涵体的方法。方法 :基因工程重组大肠杆菌 BL2 1(p ET- HU2 7)诱导表达的 Hsp A- Ure B融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性 ,在 A¨ KTA FPL C上运用 Hi Trap Chelating HP分离纯化 ,用 SDS- PAGE和 Bradford法检测目的蛋白的纯度和含量 ,用 Western blotting对纯化后蛋白进行免疫学活性鉴定。结果 :纯化后 Hsp A- Ure B融合蛋白的纯度 >90 % ,含量达 0 .2 5 g· L- 1 ,并可以被 Hsp A- U re B融合蛋白免疫小鼠血清识别。结论 :成功地建立了从包涵体中纯化高纯度 Hsp A- U re B融合蛋白的方法。 展开更多

关键词 螺杆菌 幽门 热休克蛋白质类 尿素酶 重组融合蛋白质类 包涵体 蛋白质类/分离和提化

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β-伴大豆球蛋白α-亚基核心区的基因克隆、表达及纯化 被引量：2

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作者 李垚熹 袁艳秋 +4 位作者 巨倩 高梦楠 周树义 胡亚云 栾广忠 《食品与机械》 北大核心 2020年第5期15-19,38,共6页

利用RT-PCR技术获得了齐黄34大豆种子的全长cDNA,采用自行设计的引物对目的基因αc进行扩增,并将目的基因与载体连接,构建了重组克隆载体pGEM-αc。重组克隆载体经XhoⅠ/EcoRⅠ双限制酶酶切鉴定后,与载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a... 利用RT-PCR技术获得了齐黄34大豆种子的全长cDNA,采用自行设计的引物对目的基因αc进行扩增,并将目的基因与载体连接,构建了重组克隆载体pGEM-αc。重组克隆载体经XhoⅠ/EcoRⅠ双限制酶酶切鉴定后,与载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-αc,经菌落PCR、双限制酶酶切及测序判定准确后,将其转入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,当诱导温度为37℃、菌液OD 600 nm值为0.8、诱导剂(IPTG)浓度为0.2 mmol/L,诱导时间为9 h时,重组α-亚基核心区蛋白分子质量为50 kU;工程菌pET-28a-αc-BL21经超声破裂、低温离心后,上清液利用镍离子亲和层析色谱柱经AKTA蛋白纯化系统纯化可以获得较高纯度的目的蛋白。 展开更多

关键词 Β-伴大豆球蛋白 α-亚基 重组蛋白 克隆 分离纯化

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重组大豆7S球蛋白α′-亚基的分离纯化 被引量：4

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作者 余少璟 许妍妍 +3 位作者 袁艳秋 周星杰 吉梦莹 栾广忠 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1853-1859,共7页

为分离及纯化重组大豆7S球蛋白(β-conglycinin)α′-亚基,将大肠杆菌工程菌pET-28a-α′-BL21经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,得到含有重组7S球蛋白α′-亚基目的蛋白的菌液,再经超声破碎、离心得到粗提的重组蛋白。采用AKTA蛋白... 为分离及纯化重组大豆7S球蛋白(β-conglycinin)α′-亚基,将大肠杆菌工程菌pET-28a-α′-BL21经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,得到含有重组7S球蛋白α′-亚基目的蛋白的菌液,再经超声破碎、离心得到粗提的重组蛋白。采用AKTA蛋白纯化系统利用Ni 2+亲和层析柱进一步纯化重组蛋白,当采用流速为5mL/min的平衡液平衡Ni 2+柱可以得到较高纯度的目的蛋白,纯度可达89.1%。 展开更多

关键词 7S球蛋白 α′-亚基 重组蛋白 分离 纯化

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